銅綠假單胞菌SJTD-1降解烷烴的分子機(jī)制研究.pdf

1、石油污染對生態(tài)環(huán)境的危害日益嚴(yán)重。物理化學(xué)方法治理石油污染雖然有效，但是成本高、甚至有次生污染的風(fēng)險。微生物修復(fù)技術(shù)可有效去除石油污染，具有代謝終產(chǎn)物無毒性，操作簡單，價格低廉等優(yōu)勢，但存在降解速度慢、受環(huán)境因素如溫度、pH值等影響大、修復(fù)菌株潛在的生態(tài)危害等局限性。因此，篩選或者人工構(gòu)建降解能力強(qiáng)、環(huán)境適應(yīng)性優(yōu)越、可控且無環(huán)境生態(tài)危害的工程菌株將極大地促進(jìn)微生物生態(tài)修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用。篩選石油降解菌株、確定石油降解的分子機(jī)制研究石油降解的

2、分子機(jī)制，進(jìn)而通過基因改造強(qiáng)化石油降解能力和環(huán)境適應(yīng)能力已成為當(dāng)今生物修復(fù)石油污染研究的重要研究方向。
　　本文從大慶油田污染土壤中分離獲得一株可高效利用石油烴類物質(zhì)的菌株SJTD-1，從直鏈烷烴降解效能分析、全基因組序列比對與蛋白組學(xué)分析、烷烴氧化酶的鑒定及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制這幾方面進(jìn)行系統(tǒng)研究。
　　以不同長度直鏈烷烴為單一碳源培養(yǎng)菌株SJTD-1，生長曲線顯示其在C16-C20烷烴中生長最佳，并能在高達(dá)2g/L的正十六烷培

3、養(yǎng)基中生長。氣相檢測結(jié)果顯示，該菌株在36小時內(nèi)可將500 mg/L的正十四烷，正十六烷與正十八烷全部分解，七天內(nèi)對2 g/L烷烴的分解率超過95％。以上結(jié)果說明菌株SJTD-1能高效降解直鏈烷烴。經(jīng)16S rDNA序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析表明菌株SJTD-1屬于銅綠假單胞菌，故將其命名為銅綠假單胞菌SJTD-1。
　　利用Roche454 FLX+及Illumina Miseq測序平臺對SJTD-1全基因組進(jìn)行測序?；蚪M全長6,

4、074,058 bp，預(yù)測編碼蛋白質(zhì)5560個。全基因組序列比對分析顯示，菌株SJTD-1中含有至少5個烷烴氧化酶同源蛋白，其編碼基因?yàn)閮蓚€烷烴羥化酶基因 alkB1（ SJTD-1_4712）, alkB2（ SJTD-1_3623），兩個細(xì)胞色素 P450基因（SJTD-1_5482和SJTD-1_4609），和一個almA-like黃素單加氧酶基因（SJTD-1_3206）。
　　利用 iTRAQ-based蛋白質(zhì)組學(xué)方法比

5、較以葡萄糖或正十八烷烴為單一碳源時SJTD-1全蛋白的表達(dá)差異。結(jié)果顯示共有476個差異蛋白（占據(jù)基因組編碼蛋白總量的8.4%），涵蓋攝取、代謝到能量轉(zhuǎn)化烷烴底物的完整過程，以及分泌、環(huán)境壓力、調(diào)控等細(xì)胞進(jìn)程。特別的，在表達(dá)上調(diào)蛋白中發(fā)現(xiàn)了與乙醛酸循環(huán)、趨化性、VI型分泌系統(tǒng)相關(guān)的一系列蛋白，提示當(dāng)烷烴存在時菌體這些生理活動增強(qiáng)，為探索烷烴降解途徑、改造應(yīng)用型工程菌株提供了新的研究視角。另外，基因預(yù)測的 AlkB2（SJTD-1_362

6、3編碼）的表達(dá)量上調(diào)4.05倍，說明AlkB2的表達(dá)受正十八烷烴強(qiáng)烈誘導(dǎo)，提示該蛋白在長鏈烷烴代謝中的重要作用。同時發(fā)現(xiàn)另一個與AlmA-like黃素單加氧酶有一定同源性的蛋白（SJTD-1_3636編碼）表達(dá)上調(diào)2.35倍，這是首次在假單胞菌中發(fā)現(xiàn)AlmA-like家族蛋白受長鏈烷烴誘導(dǎo)，為研究長鏈烷烴代謝機(jī)制提供了重要的數(shù)據(jù)依據(jù)。
　　通過基因敲除及 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)方法對預(yù)測的5個烷烴氧化酶進(jìn)行功能鑒定。RT-qPCR結(jié)果

7、顯示，alkB1和alkB2均受到中短鏈烷烴（n?16）不同程度誘導(dǎo)，且alkB2在長鏈烷烴（n?18）培養(yǎng)基中被誘導(dǎo)。將野生型菌株與各敲除菌生長及降解效率對比分析得知，alkB1或alkB2缺失菌株與野生型比烷烴降解譜出現(xiàn)漂移，但生長差異不十分明顯；而雙敲除菌在中短鏈烷烴培養(yǎng)基中幾乎不生長，提示中短鏈烷烴的氧化主要由兩個AlkB蛋白負(fù)責(zé)，且兩者在底物譜上存在重疊。由SJTD-1_5482和SJTD-1_4609編碼的P450蛋白和SJ

8、TD-1_3206編碼的AlmA-like蛋白分別受到短鏈和長鏈烷烴一定程度誘導(dǎo)，但是生長降解實(shí)驗(yàn)顯示它們并非主要的烷烴氧化酶。以上表明，除了AlkB2外，SJTD-1菌中仍存在未知的烷烴氧化酶參與長鏈烷烴的降解過程。
　　為闡明烷烴誘導(dǎo)烷烴羥化酶表達(dá)的分子機(jī)制，以alkB2基因上游序列為誘餌，親和純化DNA結(jié)合蛋白，顯示GntR（SJTD-1_3624）與該DNA親和性很高。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)證實(shí)該GntR蛋白與alkB1和alkB2

9、上游序列發(fā)生特異性結(jié)合，且與后者的結(jié)合十分緊密，而直鏈烷烴可抑制蛋白與DNA的結(jié)合。DNaseI足跡實(shí)驗(yàn)確定了GntR的結(jié)合位點(diǎn)位于alkB2啟動子上游30 bp處類回文結(jié)構(gòu)序列5‘-att-GT-cag-AC-aat-3‘?；蚯贸c生長降解分析進(jìn)一步證實(shí)該GntR蛋白以負(fù)調(diào)控模式直接調(diào)控alkB2的轉(zhuǎn)錄。據(jù)我們所知，至今尚無文獻(xiàn)證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子GntR直接參與烷烴降解調(diào)控的作用。
　　綜上所述，本論文對這株石油高效降解菌SJTD-