大黃魚TNFR和IgH的克隆及免疫相關(guān)基因的表達(dá)分析.pdf

1、大黃魚（Larimichthys crocea）是中國重要經(jīng)濟(jì)海水養(yǎng)殖魚類之一，為中國特有的地方性種類，人工養(yǎng)殖技術(shù)的成功使其成為目前網(wǎng)箱養(yǎng)殖量最大的魚類，但是隨著養(yǎng)殖量的增加和養(yǎng)殖環(huán)境的破壞，常常導(dǎo)致大面積疾病的爆發(fā)，其中副溶血弧菌（ Vibrio parahaemolyticus）是養(yǎng)殖大黃魚中最常見的病原菌之一，給大黃魚的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。本研究從大黃魚免疫基因入手，首先克隆獲得腫瘤壞死因子受體（ Tumor Necrosi

2、s Factor Receptor, TNFR）和免疫球蛋白重鏈（Immunoglobulin heavy chain, IgH）的cDNA全長。從實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的大黃魚EST文庫和前人的研究中篩選獲得18個(gè)免疫相關(guān)基因：Toll樣受體9（ toll-like receptor, TLR9）、Toll樣受體22（ TLR22）、腫瘤壞死因子受體13B（TNFR13B）、RAC-GTP酶（RacGTPase， RAC）、白介素8（inter

3、leukin8, IL8）、白介素10（IL10）、干擾素調(diào)節(jié)因子1（interferon regulatory factor, IRF1）、主要組織相容性復(fù)合物II a（major histocompatibility complex II a, MHCII a）、微球蛋白β2（beta-2 microglobulin, B2-M）、CC趨化因子（CC Chemokine, CC）、似CC趨化因子114（CC Chemokine-li

4、ke114, CCL114）、似CC趨化因子（CCL）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（stromal cell-derived factor1, SDF）、免疫球蛋白D（immunoglobulin D, IgD）、免疫球蛋白輕鏈（immunoglobulin light chain, IgL）、臂板蛋白4e（SEMA4e）、半胱天冬氨酸酶9（CASPASE9）和C1抑制因子（C1 inhibitor, C1-IN）。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測

5、經(jīng)副溶血弧菌注射后2 d、4 d、8 d和12 d時(shí)大黃魚脾臟中上述基因的表達(dá)變化。主要的研究結(jié)果如下：
　　（1）TNFR的cDNA全長為2016 bp，編碼449個(gè)氨基酸。預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為49.7 kDa，等電點(diǎn)為5.47。SingalP分析其5’端含有一段信號肽（1-25 aa）。功能域分析發(fā)現(xiàn)其含有死亡域（360-436 aa），TNFR/NGFR富含半胱氨酸區(qū)域（87-127 aa,129-168 aa），死亡受體域（

6、33-276 aa）和跨膜區(qū)域（10-30 aa,199-219 aa）。熒光定量PCR結(jié)果顯示TNFR基因在雌性的卵巢中表達(dá)量最高，并且脾臟中TNFR在副溶血弧菌注射2 d和4 d實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量顯著高于對照組。
　?。?）IgH的cDNA全長為1917 bp，編碼585個(gè)氨基酸。預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為65.2 kDa，等電點(diǎn)為5.84。SingalP分析其5’端含有一段信號肽（1-20 aa）。IgH含有一個(gè)82 aa的可變區(qū)（V區(qū)，

7、V36-V117）和三個(gè)恒定區(qū)（C區(qū)，C157-C229\C257-C334\C476-C552）。熒光定量 PCR結(jié)果顯示大黃魚脾臟和頭腎中IgH表達(dá)量顯著高于其它檢測的各組織，弧菌感染4 d時(shí)IgH的表達(dá)量顯著高于未感染組。
　　（3）TLR22、IL10、C1-IN、IgD和IgL在注射后的2 d實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量顯著高于對照組，IRF1和SDF在大黃魚應(yīng)激4 d和8 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量均顯著高于對照組，應(yīng)激8 d時(shí)MHCII a的