大黃魚Rac、Rab7和Rab5A基因的分子特征與免疫功能的研究.pdf

1、小G蛋白是重要的分子開關(guān)，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、細(xì)胞骨架形成、囊泡運(yùn)輸、核質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷喾N細(xì)胞功能，在免疫中發(fā)揮重要作用。本研究克隆得到大黃魚Rac1、Rac2、Rac3、Rab7和Rab5A（分別稱為lycRac1、lycRac2、lycRac3、lycRab7和lycRab5A）的cDNA序列，通過與基因組序列圖比對獲得完整的基因序列，分析了這些基因的分子特征、組織表達(dá)特性，以及LPS、PolyI∶C、副溶血弧菌等刺激后大黃魚肝臟、脾臟和腎

2、臟中的表達(dá)變化并對利用免疫膠體金技術(shù)對肝臟中表達(dá)的lycRAC2進(jìn)行亞細(xì)胞定位，利用GST-Pulldown和質(zhì)譜鑒定研究了與lycRAB5A互作的蛋白質(zhì)。主要結(jié)果如下:
　　1、RAC蛋白包括3個類型，分別為Rac1、Rac2和Rac3。lycRac1的cDNA全長2329 bp，ORF為579 bp，編碼192個氨基酸;lycRac2的cDNA全長1221 bp，ORF為579 bp，編碼192個氨基酸;lycRac3的cDN

3、A全長2182 bp，ORF為579 bp，編碼192個氨基酸。氨基酸多重比對顯示，lycRac1與海龜（Chelonia mydas）、斑馬魚（Maylandiazebra）和紅鰭東方純（Takifugu rubripes）的Rac1基因有高相似性;lycRac2與尖吻鱸（Lates calcarifer）、亞馬遜花鳉（Poecilia formosa）和劍魚（Xiphophorusmaculatus）同源性高;lycRac3與牛（B

4、ostaurus）、熱帶爪蟾（Xenopus tropicalis）和藍(lán)鯰魚（Ictalurus furcatus）有較高同源性。通過基因組分析發(fā)現(xiàn)lycRac1有6個外顯子，5個內(nèi)含子;lycRac2有7個外顯子，6個內(nèi)含子;lycRac3有7個外顯子，6個內(nèi)含子。進(jìn)化樹分析表明，lycRac1、lycRac2和lycRac3均與魚類Rac1、Rac2和Rac3聚成一支。利用熒光定量PCR技術(shù)檢測三個基因在組織中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)它們在所

5、有檢測的組織中均可以表達(dá)，其中，lycRac1在心臟中的表達(dá)量最高，血液和腦中也有較高的表達(dá)，頭腎中的表達(dá)量最低;lycRac2在頭腎中的表達(dá)量最高，腎臟和脾臟中也有較高的表達(dá)，肌肉中的表達(dá)量最低;lycRac3在血液中的表達(dá)量最高，脾臟和腦中也有較高的表達(dá)，腸中的表達(dá)量最低。大黃魚受到Lpopolysaccharide，Polyinosinic Polycytidylic acid和VibrioParahemolyticus刺激后ly

6、cRac1、lycRac2和lycRac3在肝臟、脾臟、頭腎中的表達(dá)量有不同程度的升高，純化的lycRAC2蛋白制得多抗，Western-blot結(jié)果顯示多抗特異性較高。免疫電鏡結(jié)果表明，lycRAC2亞細(xì)胞定位于細(xì)胞間質(zhì)。以上結(jié)果表明，lycRac1、lycRac2和lycRac3可能是與免疫相關(guān)的基因，它們在應(yīng)對細(xì)菌感染中發(fā)揮不可或缺的作用，lycRAC2的亞細(xì)胞定位進(jìn)一步說明lycRac2與信號傳遞有關(guān)。
　　2、Rab7是

7、屬于Ras家族的小G蛋白，lycRab7的cDNA全長2218bp，開放閱讀框(ORF)624 bp，編碼207個氨基酸。氨基酸多重比對結(jié)果顯示，lycRab7與斑馬魚（Danio rerio）、人（Homo sapiens）、家兔（Oryctolagus cuniculus）的Rab7基因同源性較高。通過基因組分析發(fā)現(xiàn)，lycRab7有5個外顯子，4個內(nèi)含子。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，lycRab7與其它魚類可以聚成一支。實(shí)時熒光定量PCR

8、結(jié)果顯示，lycRab7在12個組織中均有表達(dá)，其中腦中的表達(dá)量最高，血液和心臟中也有較高的表達(dá)，胃中的表達(dá)量最低。大黃魚受到LPS、polyI∶C、副溶血弧菌刺激后，肝臟、脾臟和頭腎中l(wèi)ycRab7的表達(dá)量均明顯上調(diào)。純化的lycRAB7蛋白制得多抗，Western-blot結(jié)果顯示多抗特異性較高。以上結(jié)果表明，lycRab7在抵御細(xì)菌入侵中發(fā)揮重要作用。
　　3、Rab5A是Ras家族的一員，已得到純化的lycRAB5A蛋白，