玉米自交系淀粉合成及其關(guān)鍵酶活性變化與玉米sbe的克隆與表達(dá).pdf

1、玉米淀粉是化學(xué)成分最佳淀粉之一，純度達(dá)99．5％，全世界淀粉80％以上來自于玉米。玉米淀粉在食品、醫(yī)藥、化工、紡織、造紙、建筑、石油化工和塑料工業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的用途?，F(xiàn)在，隨著世界經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人口的激增及資源的巨大損耗，使淀粉這種天然資源的研究變得更加迫切和重要。深入研究玉米籽粒淀粉形成的生理機(jī)制，可以為以后通過生物技術(shù)提高淀粉產(chǎn)量，改良淀粉品質(zhì)奠定基礎(chǔ)，對(duì)培育高淀粉、高品質(zhì)專用型玉米具有重要意義。本研究以兩個(gè)高淀粉和兩個(gè)低淀粉玉米自

2、交系為材料，對(duì)高淀粉玉米自交系與低淀粉自交系在籽?？偟矸?、直鏈淀粉、支鏈淀粉及蛋白質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)積累以及籽粒灌漿過程中淀粉生物合成關(guān)鍵酶活性的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了比較研究，同時(shí)對(duì)關(guān)鍵酶活性的動(dòng)態(tài)變化與淀粉積累的相關(guān)性進(jìn)行討論分析。并且通過優(yōu)化淀粉結(jié)合蛋白的分離純化方法，探討了高、低淀粉玉米自交系淀粉結(jié)合蛋白的表達(dá)差異，同時(shí)還通過反轉(zhuǎn)錄方法克隆了高淀粉玉米自交系415084-2的sbel和sbe2b的cDNA，構(gòu)建表達(dá)載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，

3、為在體外研究SBE的理化性質(zhì)、催化機(jī)理，探討SBE在玉米籽粒淀粉生物合成的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明： 1．灌漿過程中4個(gè)自交系淀粉(總淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉)含量變化趨勢(shì)均呈“S”曲線變化。高、低淀粉玉米自交系灌漿初期籽粒直鏈淀粉含量并無顯著差異，而是在灌漿中后期才逐漸表現(xiàn)差異，直鏈淀粉合成啟動(dòng)時(shí)間和積累速率的大小最終決定籽粒直鏈淀粉的含量；而支鏈淀粉含量的差異在灌漿初期就已形成，高淀粉自交系支鏈淀粉的初始積累速率比低

4、淀粉自交系大，支鏈淀粉含量與其最大積累速率并沒有必然聯(lián)系；兩個(gè)高淀粉自交系的淀粉含量及積累速率在30 DAP(Days After Pollination，授粉后天數(shù))以前都高于兩個(gè)低淀粉自交系。 2．灌漿過程中4個(gè)自交系A(chǔ)DPGPPase(腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶)、SSS(可溶性淀粉合成酶)、GBSS(顆粒結(jié)合淀粉合成酶)活性均呈單峰曲線變化，峰值都出現(xiàn)在20-30DAP(授粉后天數(shù))。兩個(gè)高淀粉自交系415084．2和3

5、14068-4的SBE(淀粉分支酶)活性呈單峰曲線變化，都在20DAP達(dá)到峰值；兩個(gè)低淀粉自交系314168-2和315062-1的SBE活性則呈雙峰曲線變化。灌漿過程中兩個(gè)高淀粉自交系的SSS和GBSS活性顯著高于兩個(gè)低淀粉自交系，4個(gè)自交系灌漿過程中SSS活性變化與支鏈淀粉含量變化一致。 3．4個(gè)自交系籽粒中直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉的積累速率與各自交系灌漿期ADPGPPase、SSS和GBSS的活性變化均呈顯著或極顯著正相

6、關(guān)；除了314168-2的SBE活性變化與淀粉積累速率呈顯著正相關(guān)外，其它自交系SBE活性變化與淀粉積累速率相關(guān)性均不顯著。各自交系關(guān)鍵酶活性之間，ADPGPPase、SSS和GBSS三者間活性變化均呈顯著或極顯著正相關(guān)，這3種酶活性變化與SBE活性變化也呈不同程度的正相關(guān)。說明ADPGPPase、SSS、GBSS在催化籽粒淀粉合成可能形成多酶復(fù)合體協(xié)同起催化作用。 4．玉米籽粒最終的蛋白質(zhì)含量主要取決于灌漿后期的回升速率，與前

7、期含量的關(guān)系不明顯：灌漿前期，過高的蛋白質(zhì)含量將影響淀粉的積累，而成熟期蛋白質(zhì)含量對(duì)淀粉積累的影響不大。灌漿過程中各自交系蛋白質(zhì)含量與總淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉含量間呈負(fù)相關(guān)。 5．從SGAPs(Starch Granule-Associated Protein淀粉結(jié)合蛋白)提取條件來看，SDS(十二烷基硫酸鈉)對(duì)于SGAPs(淀粉結(jié)合蛋白)的分離純化十分重要。研究表明不同濃度SDS提取的樣品SBEⅡb，SSI，GBSSI，ze

8、in含量不一樣，其中10％的SDS緩沖液對(duì)SBEⅡb，SSI，GBSSI，zein蛋白的提取含量最大，而且提取SGAPs總量也高，說明提取SGAPs時(shí)的最適SDS緩沖液濃度為10％。在煮沸時(shí)間的確定中，煮沸5 rain時(shí)提取的SGAPs明顯比其它時(shí)間總蛋白量最高，但目的帶含量并不高，煮沸2-3 min時(shí)SBEIIb，SSI，GBSSI蛋白質(zhì)含量較高，但蛋白總量并不高。說明隨著煮沸時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白提取量的增大主要是由于zein蛋白提取量增

9、加而引起的，而目的蛋白的含量并沒有顯著提高，尤其是GBSSI蛋白含量是在煮沸2-3 min時(shí)最高。 6．從高、低淀粉自交系SGAPs動(dòng)態(tài)表達(dá)上來看，在15-35 DAP時(shí)，提取SGAPs的總量出現(xiàn)兩頭低中間高的趨勢(shì)，并且在20-30 DAP時(shí)達(dá)到穩(wěn)定，高、低淀粉玉米自交系GBSSI蛋白的表達(dá)規(guī)律基本相同，但SBEⅡb、SSI、zein蛋白表達(dá)差別很大。 7.根據(jù)GenBank公布sbe1和sbe2b cDNA序列，分別設(shè)

10、計(jì)了兩對(duì)含有酶切位點(diǎn)的引物，克隆了高淀粉自交系415084-2的sbe1和sbe2b cDNA。它們堿基序列和GenBank上序列同源性達(dá)99％，并對(duì)SBEI和SBEⅡb蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。PredictProtein預(yù)測(cè)SBEI的14.82％的氨基酸殘基形成由6個(gè)a螺旋(a helix)，19.32％氨基酸殘基形成15個(gè)β折疊，其余65.86％的氨基酸殘基形成33個(gè)隨機(jī)卷曲(random coil)，54.56％氨基酸殘基處

11、于蛋白質(zhì)表面。PredictProtein預(yù)測(cè)SBE Ⅱ b蛋白的14.39％的氨基酸殘基形成7個(gè)a螺旋，18.90％氨基酸殘基形成17個(gè)β折疊，其余66.71％的氨基酸殘基形成37個(gè)隨機(jī)卷曲(random coil)，57.45％氨基酸殘基處于蛋白質(zhì)表面。由于SBE I和SBE Ⅱ b蛋白α螺旋含量較少，說明它們可能都是親水的蛋白質(zhì)。SWISS-MODEL軟件對(duì)這兩個(gè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示它們都是球狀蛋白質(zhì)，而且有些相似。