玉米籽粒淀粉積累及相關(guān)酶活性分析

1、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)200841(7):21742181ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864j.issn.05781752.2008.07.041收稿日期：20060426；接受日期：20061101基金項目：國家科技支撐計劃（2006BAD0ZA09）、山東省農(nóng)業(yè)良種產(chǎn)業(yè)化（魯財2007，100號）和青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才啟動基金（630629）作者簡介：張海艷（1978），女，山東桓臺人，博士，研究方向為

2、種子生物學(xué)。Email：hyzhang608@。通訊作者高榮岐（1950），女，山東章丘人，教授，研究方向為種子生物學(xué)。Tel：05388242458；Fax：05388242226；Email：gaqi@玉米籽粒淀粉積累及相關(guān)酶活性分析張海艷1，2，董樹亭1，高榮岐1，李玉全2（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，山東泰安271018；2青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島266109）摘要：【目的】分析玉米籽粒發(fā)育過程中灌漿速率、蔗糖代謝、淀

3、粉積累及相關(guān)酶活性的變化，了解玉米籽粒淀粉積累的控制機(jī)理?！痉椒ā恳愿叩矸塾衩祝ㄙM(fèi)玉3號）和普通玉米（豫玉22）為材料，進(jìn)行大田試驗，采用比色法測定蔗糖含量，采用雙波長法測定淀粉及其組分含量的變化動態(tài)，參照Douglas等的方法測定蔗糖合成酶（SS）活性，參照Nakamura等的方法測定腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADPGPPase）、束縛態(tài)淀粉合成酶（GBSS）、淀粉分支酶（SBE）和去分支酶（DBE）的活性?！窘Y(jié)果】灌漿速率、蔗糖含

4、量、淀粉積累速率及SS、GBSS、SBE活性的高低均存在明顯的基因型差異，授粉后10d后，費(fèi)玉3號上述指標(biāo)均高于豫玉22。相關(guān)性分析表明，灌漿中后期SS活性與淀粉積累速率和籽粒灌漿速率均呈（極）顯著正相關(guān)；ADPGPPase、DBE活性與淀粉積累速率和籽粒灌漿速率的相關(guān)性未達(dá)到顯著水平；GBSS活性與直鏈淀粉積累速率呈極顯著正相關(guān)，與籽粒灌漿速率相關(guān)性不顯著；SBE活性與支鏈淀粉積累速率和籽粒灌漿速率呈極顯著正相關(guān)?！窘Y(jié)論】ADPGPP

5、ase和DBE不是影響玉米籽粒中淀粉積累的關(guān)鍵酶；SS是淀粉積累的限速因子；GBSS對直鏈淀粉積累起重要的調(diào)節(jié)作用；SBE對支鏈淀粉積累起關(guān)鍵作用。關(guān)鍵詞：玉米；籽粒；直鏈淀粉；支鏈淀粉；灌漿速率；酶活性StarchAccumulationEnzymesActivitiesAssociatedwithStarchSynthesisinMaizeKernelsZHANGHaiyan12DONGShuting1GAORongqi1LIYuq

6、uan2(1StateKeyLabatyofCropBiologyShongAgriculturalUniversityTai’an271018Shong2QingdaoAgriculturalUniversityQingdao266109Shong)Abstract:【Objective】Fillingratestarchaccumulationindevelopingmaizekernelwereanalyzed.Thechange

7、sofenzymeactivitiesassociatedwithsucrosemetabolismstarchbiosynthesiswereinvestigated.Thepurposeistoanalyzetheenzymaticmechanismsresponsiblefstarchsynthesis.【Method】Twotypesofmaize(Zeamays)cultivarshighstarchmaize(Feiyu3)

8、nmalmaize(Yuyu22)weregrowninacnfield.Sucrosecontentwasdeterminedwithcolimetry.Contentofstarchitscomponentwasmeasuredwiththemethodofdoublewavelength.Sucrosesynthase(SS)activitywasassayedusingthemethoddescribedbyDouglaseta

9、l.ADPglucosepyrophosphylase(ADPGPPase)granuleboundstarchsynthase(GBSS)starchbranchingenzyme(SBE)starchdebranchingenzyme(DBE)activitieswereassayedusingthemethoddescribedbyNakamuraetal.【Result】Kernelfillingratesucroseconte

10、ntstarchaccumulatingratestheactivitiesofSSGBSSSBEofFeiyu3whichhashighstarchcontentweresignificantlyhigherthanthoseofYuyu22whichhaslowstarchcontentafter10DAP(daysafterpollination).CrelationanalysisindicatedthatADPGPPaseDB

11、EwerenotcrelatedwithstarchaccumulatingrateskernelfillingratebutSSactivityatthedlelateperiodswere(highly)significantlycrelatedwithstarchaccumulatingrateskernelfillingrate.GBSSactivitywashighlysignificantlycrelatedwithamyl

12、oseaccumulatingratebutnotcrelatedwithkernelfillingrate.SBEactivitywashighlysignificantlycrelatedwithamylopectinaccumulatingratekernelfillingrate.【Conclusion】ItisnotADPGPPaseDBEbutSSistheratelimitingfactofstarchbiosynthes

13、isindevelopingmaizekernels.GBSShasanimptanteffectonamyloseaccumulation.SBEhasasignificanteffectonamylopectinaccumulation.Keywds:Maize(Zeamays)KernelAmyloseAmylopectinKernelfillingrateEnzymeactivity7期張海艷等：玉米籽粒淀粉積累及相關(guān)酶活性分析

14、21750引言【研究意義】淀粉是玉米籽粒的主要組成成分，占籽粒干重的70%左右，因此玉米籽粒的灌漿過程主要是淀粉合成和積累的過程。莖、葉等源器官制造的光合產(chǎn)物以蔗糖形式運(yùn)輸?shù)綆炱鞴伲ㄗ蚜＃?，在一系列酶的催化作用下形成淀粉[1]。深入了解淀粉合成相關(guān)酶的活性變化特征，有助于進(jìn)行酶學(xué)調(diào)控和遺傳改良，對改善玉米品質(zhì)和提高產(chǎn)量具有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】許多學(xué)者從蔗糖代謝和淀粉合成相關(guān)酶活性等方面探討籽粒淀粉形成的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)催化蔗糖降解

15、的酶是SS（蔗糖合成酶）[2]，催化淀粉合成的酶有UGPase（尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶）[3]、ADPGPPase（腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶）[4~6]、SSS（可溶性淀粉合成酶）[7]、GBSS（束縛態(tài)淀粉合成酶）[8~12]、SBE（淀粉分支酶）[1314]和DBE（去分支酶）[1516]。SS催化籽粒淀粉合成反應(yīng)的第一步，將蔗糖分解為果糖和UDPG（尿苷二磷酸葡萄糖）。UGPase催化UDPG與PPi（無機(jī)焦磷酸）反應(yīng)生成G

16、1P（1磷酸葡萄糖）和UTP（尿苷三磷酸），ADPGPPase催化G1P與ATP反應(yīng)生成淀粉合成的最直接前體ADPG（腺苷二磷酸葡萄糖）。SSS通常以游離態(tài)存在于胚乳淀粉體中，催化ADPG與淀粉引物（葡聚糖）反應(yīng)，將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上，使淀粉鏈延長。GBSS與SSS的作用相同，催化淀粉分子的鏈加長反應(yīng)，但其必須在淀粉粒內(nèi)部形成一定的晶體結(jié)構(gòu)后才能起作用。SBE又稱Q酶，作用是形成α1，6糖苷鍵，從而形成分支的糖鏈。DBE又稱R酶

17、，能專一性地裂解支鏈淀粉的α1，6糖苷鍵，對淀粉的結(jié)構(gòu)起“修飾”作用。水稻上報道ADPGPPase、淀粉合成酶和Q酶在籽粒灌漿中起重要的調(diào)控作用[17~20]；小麥上研究表明SS、ADPGPPase、SSS、GBSS是籽粒淀粉合成的可能限制因子[21~23]，ADPGPPase、SSS對籽粒支鏈淀粉和總淀粉積累起重要的調(diào)節(jié)作用，GBSS對直鏈淀粉積累起重要作用[24]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】玉米上類似的報道較少，有關(guān)高淀粉玉米和普通玉米淀粉合

18、成的比較研究未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗以典型高淀粉玉米和普通玉米為試材，分析籽粒發(fā)育過程中灌漿速率、蔗糖代謝、淀粉積累及相關(guān)酶活性的變化特點(diǎn)，以期明確玉米籽粒淀粉積累的酶學(xué)機(jī)理。1材料與方法1.1材料種植高淀粉玉米試材為費(fèi)玉3號（Feiyu3，淀粉含量（74.861.86）%），普通玉米為豫玉22（Yuyu22，淀粉含量（68.031.32）%）。2004年種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米科技園，密度45000株ha，小區(qū)18m2.5m

19、，隨機(jī)排列，重復(fù)3次。1.2取樣方法開花前選擇生長發(fā)育一致的植株掛牌標(biāo)記，開花期人工授粉。自授粉之日起每5d取8個果穗的中部籽粒混勻后分為兩部分，一部分液氮速凍后－50℃條件下保存，用于蔗糖含量和酶活性分析；另一部分105℃殺青后80℃烘至恒重，用于籽粒灌漿和淀粉積累分析。1.3測定方法1.3.1蔗糖含量測定參照張志良等[25]的方法。0.2ml80%乙醇提取液，加入200?l2molL1NaOH混勻，沸水浴10min，分解掉果糖、葡萄

20、糖等還原糖。加入2ml30%HCl混勻，80℃保溫10min，加入1ml1%間苯二酚，混勻后80℃再次保溫10min，冷卻后在480nm波長下比色。由蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蔗糖含量。1.3.2淀粉含量測定及積累速率計算淀粉含量測定參照何照范[26]的雙波長法。用Rn=（Cn5－Cn5）10計算淀粉積累速率，其中n為授粉后天數(shù)，Rn為第n天的淀粉積累速率，Cn5為第n5天的淀粉含量，Cn5為第n－5天的淀粉含量。1.3.3SS、ADPGPPas

21、e、GBSS、SBE和DBE活性的測定稱取3～10個籽粒，加5mlHepesNaOH緩沖液（pH7.5），冰浴研磨。取30?l勻漿，加1.8ml緩沖液，微離心，沉淀用緩沖液懸浮后用于GBSS活性的測定。其余勻漿10000g冷凍離心15min，上清液用于SS、ADPGPPase、SBE和DBE活性的測定。其中SS活性測定參照Douglas等[27]的方法；ADPGPPase和SBE活性測定參照Nakamura等[28]的方法；GBSS活性