人巨細(xì)胞病毒部分抗原決定簇基因的克隆、表達(dá)及初步應(yīng)用.pdf

1、人巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus HCMV)為皰疹病毒科β屬的雙螺旋DNA病毒，在世界范圍內(nèi)分布。HCMV不僅是人類先天性病毒感染的主要病原，而且是免疫功能低下人群(艾滋病患者、器官移植者、免疫抑制治療者等)并發(fā)感染死亡的常見原因之一。由于HCMV感染者通常無癥狀或無特異性癥狀，建立HCMV快速、敏感、特異的實(shí)驗(yàn)室檢測方法并采取早期治療措施對優(yōu)生、優(yōu)育及阻止HCMV的傳播具有重要意義。 HCMV感染的檢測

2、方法包括病毒分離培養(yǎng)、核酸測定、抗原檢測和血清學(xué)檢測等，每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。HCMV原發(fā)感染的檢測，主要采用血清學(xué)方法。HCMVIgM是機(jī)體受病毒抗原刺激后最早產(chǎn)生的抗體，是活動性HCMV感染的重要指標(biāo)之一，因而是檢測HCMV感染的常用指標(biāo)。 目前國內(nèi)存在大量檢測血清HCMV IgM的試劑盒，多使用從HCMv感染的人胚肺二倍體細(xì)胞中粗提取的完整病毒抗原，各種檢測方法對相同血清的檢測結(jié)果有很大差別，即是符合率較差。其主要原因?yàn)椋?

3、．病毒抗原的制備及純化方法各不相同；2．提取物中含有多種抗原成分，很難進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；3．制備抗原所需的HCMV要在人胚肺細(xì)胞中培養(yǎng)，此細(xì)胞的蛋白可能對制備的抗原產(chǎn)生污染；4．皰疹病毒有共同抗原，完整的HCMV抗原可以與其它非HCMV病毒感染產(chǎn)生的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。 由于病毒來源的抗原存在敏感性、特異性、標(biāo)準(zhǔn)化等問題，將通過基因工程方法獲得的表達(dá)產(chǎn)物作為檢測用抗原已引起各國學(xué)者重視。國內(nèi)外研究工作者對人巨細(xì)胸病毒的一些抗原決定簇進(jìn)行

4、了免疫原性和特異性研究，期待能夠應(yīng)用于人巨細(xì)胞病毒感染的早期診斷。其中g(shù)p52(UL44)、ppl50(ppUL32)、pp65(ppUL83)、ppUL80a均為強(qiáng)免疫原性蛋白且具有保守的DNA序列，能夠特異性識別H(3MV IgM抗體。因此，本研究選擇HCMV gp52(UL44)、ppl50(ppUL32)、pp65(ppUL83)、ppUL80a，抗原性好、特異性強(qiáng)的部分基因片段作為目的基因，應(yīng)用基因工程技術(shù)，得到高效表達(dá)的目的

5、工程菌，并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了抗原性研究。 此次研究從HCMV感染的細(xì)胞上清液中提取HCMV基因組，本試驗(yàn)用PCR方法從基因組中擴(kuò)增獲得pp150 aa595-614(A)、pp150 aa1006-1042(B)、gp52aa202-434(C)、pp65 aa297-510(D)、ppUL80a，aa117-373(E)氨基酸之間的多肽片段的編碼基因，用重組PCR的方法將前三個片段重組為新的DNA片段(F)，將D、E、F片段分別

6、克隆至pMD-18T載體測序，核苷酸序列分析證明了PCR擴(kuò)增目的序列的正確性。測序正確的片段克隆至原核表達(dá)載體pCEX-4T-1，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功表達(dá)了上述三種蛋白，分別命名為GST-ppUL83、GST-ppUL80a、GST-LINK。通過Western blotting檢測其免疫特性，結(jié)果顯示三種蛋白均能被羊抗人巨細(xì)胞病毒多克隆抗體及HCMV IgM陽性血清特異性識別，而載體蛋白與多克隆抗體

7、及陽性血清并不能發(fā)生反應(yīng)，證明這三種蛋白具有良好的抗原特異性，可期待應(yīng)用于人巨細(xì)胞病毒感染的珍斷。經(jīng)蛋白電泳分析表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在，根據(jù)這三種蛋白不同的理化特性，采用不同的方法進(jìn)行蛋白純化，獲得了較好的純化效果。 時間分辨熒光免疫分析(Time-FeSOlved fluoroimmunoassay，TRFIA)是上世紀(jì)八十年代興起的一種新型非放射性標(biāo)記技術(shù)，TRFIA巧妙利用鑭系元素的熒光特點(diǎn)，克服了普通熒光檢測中背

8、景熒光強(qiáng)度大、干擾強(qiáng)的缺點(diǎn)，使強(qiáng)特異性熒光和背景熒光分辨開，幾乎可以完全消除背景熒光的干擾，提高了檢測的靈敏度。與現(xiàn)在廣泛使用的放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)、電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)相比，具有靈敏度高、操作簡便、示蹤物穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾、無放射性污染、對標(biāo)記物分子生物活性影響小、多標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為生物學(xué)研究和臨床超微量生化檢驗(yàn)中一項(xiàng)頗有發(fā)展前景的分析手段。

9、為分析本實(shí)驗(yàn)所表達(dá)純化的三種目的蛋白與HCMV IgM的反應(yīng)能力，將目的蛋白及Microbix Biosystems公司的完整病毒裂解抗原CMV grade2 antigen，運(yùn)用捕獲法TRFIA檢測已知HCMV IgM陽性及陰性的血清，兩種反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行直線相關(guān)分析。分析結(jié)果顯示，三種目的蛋白單獨(dú)應(yīng)用檢測血清的結(jié)果與完整裂解抗原的檢測結(jié)果呈正相關(guān)，但效果不甚理想(r<,s>分別為0.947，0.879，0.957)。將三種目的蛋白聯(lián)合應(yīng)

10、用檢測血清的結(jié)果與完整裂解抗原的結(jié)果具有良好的相關(guān)性，r<,s>=0.989，P<0.001，效果明顯好于融合蛋白單獨(dú)應(yīng)用。其主要原因是雖然本實(shí)驗(yàn)所選擇gp52、pp150、pp65、ppUL80a均為強(qiáng)免疫原性蛋白且具有保守的DNA序列，對HCMV IgM抗體具有一定的敏感性和特異性，但其可能只與HCMV感染的不同階段機(jī)體產(chǎn)生的特異性IgM發(fā)生反應(yīng)。將三者聯(lián)合應(yīng)用，檢測效果與完整病毒裂解抗原的檢測效果呈良好的正相關(guān)關(guān)系，說明目的蛋白聯(lián)