RNAi沉默F(xiàn)AK基因表達(dá)對乳腺癌MCF-7細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)資料統(tǒng)計，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7～10％，在西方國家其發(fā)病率及死亡率均居女性惡性腫瘤之首。我國女性乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，而且發(fā)病年齡有年輕化的趨勢，乳腺癌已成為對婦女健康的最大威脅。乳腺癌治療主要以手術(shù)、化療、放療及內(nèi)分泌治療為主，隨著治療技術(shù)的不斷提高，其生存率有了很大的改善，病死率顯著下降。但腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致許多病人死亡的原因之一，也是影響腫瘤預(yù)后主要指標(biāo)和指導(dǎo)治療的重要依據(jù)。許

2、多學(xué)者致力于腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的分子學(xué)研究，以期能發(fā)現(xiàn)更精確可靠的生物學(xué)標(biāo)志物。腫瘤細(xì)胞在整合蛋白介導(dǎo)下與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）粘附是腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的重要原因之一，在整合蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中粘著斑激酶起關(guān)鍵作用。粘著斑激酶（Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是一種非受體酪氨酸激酶，它在細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附中起關(guān)鍵作用。研究證明，F(xiàn)AK在乳腺癌、直腸癌、甲狀腺癌、肝癌、前列腺癌中表達(dá)量增高，且與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移密切相

3、關(guān)。本課題以女性常見惡性腫瘤乳腺癌為研究對象，研究利用RANi干擾FAK表達(dá)及對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 目的：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建針對人粘著斑激酶FAK的siRNA表達(dá)載體，研究RNA干擾FAK的表達(dá)及對人類乳腺癌MCF-7細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。 方法：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的FAK基因序列（GI：439874）構(gòu)建表達(dá)FAK基因siRNA的重組質(zhì)粒FAK-pGenesil-siRNA，并隨機(jī)設(shè)計一條陰性

4、對照FAK-pGenesil-HK。測序鑒定后，在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染入人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測FAK mRNA和蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布，體外實驗測定腫瘤細(xì)胞穿透matrigel的能力。 結(jié)果： （1）經(jīng)過優(yōu)化細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件，當(dāng)所構(gòu)建的重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體的質(zhì)量體積比為1：4（μg/μ1）轉(zhuǎn)染時，轉(zhuǎn)染效率較高，可達(dá)60％以上。

5、 （2）RT-PCR及Western blot結(jié)果：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒FAK-pGenesil-siRNA后能使乳腺癌MCF-7細(xì)胞株FAK mRNA及蛋白的表達(dá)下調(diào)。干擾組FAK mRNA抑制率為61.80％，與陰性對照組0.31％比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；干擾組FAK蛋白抑制率為46.55％，與陰性對照組8.62％比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。 （3）流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期結(jié)果：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48小時

6、后，轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒FAK-pGenesil-siRNA的干擾組MCF-7細(xì)胞增殖指數(shù)為25.89±0.26％，陰性對照組和空白對照組分別為37.96±0.60％、38.21±0.56％。與干擾組相比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；與干擾組相比，陰性對照組和空白對照組有更多的細(xì)胞被阻滯于G0-G1期。體外侵襲實驗結(jié)果：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48小時后，轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒FAK-pGenesil-siRNA的干擾組MCF-7細(xì)胞穿過Matrigel