大豆貯藏蛋白基因啟動(dòng)子的克隆與功能分析.pdf

1、目前，基因工程中存在的主要問題之一是外源基因的表達(dá)水平、表達(dá)部位等問題，因此，作為調(diào)控基因表達(dá)關(guān)鍵元件之一的啟動(dòng)子的研究便成為基因工程研究的關(guān)鍵。根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為三類：組成型啟動(dòng)子(constitutive promoter)、組織特異性啟動(dòng)子(tissue-specific promoter)和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(inducible promoter)三種。迄今為止，植物表達(dá)載體中應(yīng)用最廣泛的是CaMV 35S組成型啟動(dòng)子，它

2、導(dǎo)致外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和所有發(fā)育階段都表達(dá)，不但造成能源的浪費(fèi)還會(huì)引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植物的生長發(fā)育。這就使人們越發(fā)注重特異表達(dá)啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用，特異性啟動(dòng)子指導(dǎo)外源基因定向地在人們預(yù)定的時(shí)間和空間(組織或器官)表達(dá)，不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定空間積累，增加區(qū)域表達(dá)量，并且使外源基因的表達(dá)處于人們的控制之下，既保證了外源基因在植物體內(nèi)的有效發(fā)揮又減少了對植物的不良影響。利用具有特異性表達(dá)特性的啟動(dòng)子被認(rèn)為是實(shí)

3、現(xiàn)對目標(biāo)基因高表達(dá)的重要途徑，也是培育高效、安全轉(zhuǎn)基因作物的首選。 11S球蛋白是大豆種子中主要的貯藏蛋白，由多基因家族編碼，迄今為止已有七個(gè)大豆球蛋白基因被克隆、測序，分別是Gy1至Gy7。大豆種子貯藏蛋白具有種子特異性時(shí)序表達(dá)的功能，在種子成熟的中后期瞬時(shí)性的大量合成并貯存于種子蛋白體中。這種種子特異性時(shí)序表達(dá)的功能主要取決于種子貯藏蛋白基因上游調(diào)控序列，所以貯藏蛋白基因啟動(dòng)子成為了研究高等植物基因特異性表達(dá)調(diào)控的首選材料。

4、我們以大豆品種“吉農(nóng)T7018”的基因組DNA為模板，根據(jù)已發(fā)表11S球蛋白G7亞基(Gy7)基因(GenBankAF319776)序列，設(shè)計(jì)一對引物，通過PCR擴(kuò)增得到Gy7基因的啟動(dòng)子序列。將其克隆到pMD18-T Vector上，經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白斑堿裂解法提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR檢測和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，鑒定后的菌株送交大連寶生物公司測序，并進(jìn)行BLAST分析。測序結(jié)果表明所克隆的片段長為963bp，與預(yù)期設(shè)計(jì)

5、的大小一致，該片段與已發(fā)表的11S球蛋白基因啟動(dòng)子序列的相似性為45.2％，但所含的啟動(dòng)子序列元件的數(shù)量和距離上很相似，均具有有典型的TATA盒和CAAT盒，以及種子特異表達(dá)所必須的調(diào)控元件。 用該啟動(dòng)子取代植物表達(dá)載體pBI121的CaMV35S啟動(dòng)子，與GUS基因編碼區(qū)連接，獲得了由該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的新型植物表達(dá)載體pGy-GUS。通過液氮凍融法將重組質(zhì)粒pGy-GUS、質(zhì)粒pBI121分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA440

6、4中，采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草品種NC89。在含有 Kan 和Cef抗生素的MS選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，結(jié)果獲得6株轉(zhuǎn)pGy-GUS基因植株。對6株轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行 PCR 檢測，以未轉(zhuǎn)基因的植株作為陰性對照，結(jié)果6株再生苗擴(kuò)增出與目的片段大小一致的條帶。對PCR檢測呈陽性的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Southern雜交檢測，雜交結(jié)果顯示有4株有明顯雜交信號(hào)，說明目的基因已成功整合到煙草基因組中。為了驗(yàn)證所擴(kuò)增的啟動(dòng)子是否具有種子特異性表達(dá)的功能，我們對轉(zhuǎn)

7、pGy-GUS、pBI121質(zhì)粒煙草的根、莖、葉、種子分別進(jìn)行GUS組織化學(xué)分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)pGy-GUS質(zhì)粒煙草的根、莖、葉未顯色，而種子顯藍(lán)色，表現(xiàn)出明顯的種子特異性；而轉(zhuǎn) pBI121質(zhì)粒煙草的根、莖、葉、種子均顯藍(lán)色，由此初步得出結(jié)論：由該啟動(dòng)子序列引導(dǎo)的GUS基因能在種子中表達(dá)，而在其它組織中未表達(dá)，證實(shí)該啟動(dòng)子具有種子特異性表達(dá)的功能。本論文的完成為貯藏蛋白基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究提供理論依據(jù)，還可以在植物的特定部位或發(fā)育階