實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腸道病毒方法的建立.pdf

1、目的：制備實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腸道病毒的標(biāo)準(zhǔn)品，以制備的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行腸道病毒的絕對(duì)定量。
　　 方法：采用T-A克隆技術(shù)制備熒光定量PCR檢測(cè)腸道病毒的標(biāo)準(zhǔn)品。設(shè)計(jì)合成腸道病毒通用引物，進(jìn)行梯度PCR選擇最佳退火溫度，在此溫度下以脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ型Sabin株RNA逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板進(jìn)行PCR，產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳回收純化，純化后DNA連接入pGEM-T-easy載體，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，在LB/氨/IPTG/X-Ga

2、l 平板上進(jìn)行藍(lán)白篩選，挑取陽性克隆菌在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中搖菌增殖，提取細(xì)菌中的質(zhì)粒，EcoRⅠ酶切鑒定，電泳分析酶切片段是否含有目的片段。測(cè)序分析插入片段與模板片段堿基是否一致，測(cè)定純化質(zhì)粒濃度并換算為拷貝數(shù)濃度，以此標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR。首先優(yōu)化引物濃度，反應(yīng)條件95℃10 min激活Taq酶，95℃15 s變性，60℃ 1 min退火延伸，變性退火延伸循環(huán)40次。隨后增加繪制融解曲線程序，觀察產(chǎn)物特異性。根據(jù)擴(kuò)增曲線

3、，Ct值選擇最佳引物濃度。以選定的引物濃度，十倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR，模板用量為1μl，PCR Master Mix 10μl，其余為引物和滅菌水共20μl體系，反應(yīng)條件如前。根據(jù)Ct值與拷貝數(shù)的關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出擴(kuò)增效率、相關(guān)系數(shù)等值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該方法的穩(wěn)定性，重復(fù)性及靈敏度。采用TCID50檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒的滴度，將其十倍系列稀釋，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行熒光定量PCR，分析不同稀釋度的已知滴度的脊髓灰質(zhì)炎病毒

4、TCID50與熒光定量PCR結(jié)果的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：普通PCR最佳退火溫度58℃，藍(lán)白篩選顯示連接、轉(zhuǎn)化成功，酶切鑒定、普通PCR及測(cè)序分析顯示質(zhì)粒中含有目的片段，純化后質(zhì)粒濃度均在1010 copies/μl左右。此標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，選取優(yōu)化后引物濃度為300 nM/300 nM，該檢測(cè)方法的檢測(cè)范圍為108～103 copies/μl，靈敏度為103 copies/μl，脊髓灰質(zhì)炎病毒TCID5