EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR同時(shí)檢測多種豬病毒研究.pdf

1、豬細(xì)小病毒(Porcineparvovirus，PPV)、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(Porcinecircovirus2，PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合癥（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）、豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）、日本腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)、偽狂犬病病毒(Pseudorabiesv

2、irus，PRV)這幾種病毒引起的疾病在臨床上常呈現(xiàn)出相似的呼吸和繁殖障礙癥狀，并且常常呈混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失。依據(jù)常規(guī)病原學(xué)檢測及臨床病理變化很難作出準(zhǔn)確的判斷，尤其是多種病原混合感染時(shí)，難以進(jìn)行早期快速檢測，容易產(chǎn)生誤判錯(cuò)判，因此建立一種快速準(zhǔn)確能同時(shí)對多種病原進(jìn)行檢測的方法對疾病的診斷和防治具有重要意義，而兼有多重PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR優(yōu)點(diǎn)的多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法可以應(yīng)用于多病原混合感染的快速檢測。
　　多重實(shí)時(shí)熒

3、光PCR包括熒光探針和熒光染料兩類。探針多重實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性較好，但由于受到實(shí)時(shí)熒光PCR儀器檢測通道限制，無法同時(shí)進(jìn)行四種以上的病原檢測，而且設(shè)計(jì)多條探針會(huì)增加總成本。熒光染料多重實(shí)時(shí)熒光PCR是通過識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物熔解峰以達(dá)到檢測目的，不受檢測通道限制。熒光染料EvaGreen相比SYBRGreenⅠ具有更高敏感性和穩(wěn)定性，而且在多重檢測中克服了對擴(kuò)增子的結(jié)合偏愛性，因此EvaGreen更適合于多重實(shí)時(shí)熒光PCR，基于本研究建立的

4、EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，能夠快速有效的同時(shí)檢測六種豬病毒，并具有簡便易行、成本較低等優(yōu)點(diǎn)。
　　基于最終需要建立EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，本研究首先建立了六種豬病毒EvaGreen單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，其中六種病毒經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生的熔解峰能夠有效區(qū)分，是各病毒單重實(shí)時(shí)熒光PCR優(yōu)化的前提條件，通過選定的引物同時(shí)對目的核酸序列和非目的核酸序列擴(kuò)增來檢測特異性，結(jié)果顯示PCV2、PPV、P

5、RRSV、CSFV、JEV和PRV均無非特異性擴(kuò)增;并進(jìn)行六種病毒的靈敏度檢測，其中PCV2和CSFV的檢測極限可達(dá)10copies/μl,PRV和JEV的檢測極限可達(dá)25copies/μl，PPV和PRRSV的檢測極限可達(dá)50copies/μl;分別選取各病毒的3個(gè)濃度進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)，變異系數(shù)均在5％以內(nèi)，顯示各病毒單重實(shí)時(shí)熒光PCR重復(fù)性良好。在六種豬病毒EvaGreen單重實(shí)時(shí)熒光PCR優(yōu)化完成的基礎(chǔ)上，建立一個(gè)EvaGr

6、een多重實(shí)時(shí)熒光PCR體系，經(jīng)實(shí)時(shí)擴(kuò)增能夠產(chǎn)生六個(gè)目的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解峰，其中PCV2擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解峰相應(yīng)的熔解溫度(Tm)為77.7±0.29℃，PPV為79.5±0.36℃，PRRSV為82.2±0.30℃，CSFV為85.3±0.35℃，JEV為87.3±0.31℃及PRV為91.3±0.25℃，從而可同時(shí)對這六種病毒進(jìn)行檢測。通過分別加入靶基因和非靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測特異性，結(jié)果顯示六種豬病毒在EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PC

7、R中均無非特異性擴(kuò)增;并進(jìn)行了靈敏度檢測，靈敏度結(jié)果顯示:PCV2、PRRSV和JEV的檢測極限達(dá)到100copies/μl;PPV、CSFV檢測極限可以達(dá)到250copies/μl;PRV的檢測極限可以達(dá)到500copies/μl;同時(shí)進(jìn)行了批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示批內(nèi)和批間重復(fù)的Tm變異系數(shù)均在5％以內(nèi)。由于多病原混合感染也常出現(xiàn)在實(shí)際檢測中，故選取幾種較易發(fā)生混合感染的病毒組合進(jìn)行靈敏度檢測，其中在CSFV濃度為106copi

8、es/μl時(shí)，PCV2靈敏度可達(dá)250copies/μl;PCV2濃度為105copies/μl時(shí)，PRRSV靈敏度可達(dá)250copies/μl;PPV濃度為106copies/μl時(shí)，PCV2靈敏度可達(dá)500copies/μl;PCV2、PPV濃度分別為105copies/μl和106copies/μl時(shí)，PRRSV的最低檢測極限為500copies/μl。本研究表明，六種豬病毒的多重EvaGreen實(shí)時(shí)熒光PCR方法具有較好的特異性

9、、靈敏度、重復(fù)性。
　　應(yīng)用建立的EvaGreen多重?zé)晒釶CR方法對58份血清和60份組織樣品分別進(jìn)行了檢測。58份血清樣品中，PCV2的陽性率為19.0％，PRRSV的陽性率為24.1％，PCV2與PRRSV混合感染占總樣品數(shù)10.3％;在對60份組織樣品檢測中，PCV2、PPV、PRRSV和PRV檢出率分別為23.3％、15％、16.7％及5％，PCV2與PRRSV、PCV2與PPV及PCV2、PPV與PRRSV混合感染檢出