芝麻、花生、豌豆物種特異性PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法研究.pdf

1、目前，隨著人們生活水平的提高，食品質(zhì)量與安全問題常常困擾著每一位消費(fèi)者。在食品加工過程中，以次充好，以假亂真的現(xiàn)象屢見不鮮。因此，食品質(zhì)量的問題也備受人們關(guān)注。芝麻、花生、豌豆?fàn)I養(yǎng)豐富，是食品中常用的原材料，也是日常生活中人們喜愛的食材，如芝麻油、芝麻醬、綠豆糕點(diǎn)制品等。但市場上的芝麻油、芝麻醬、綠豆糕點(diǎn)也常常出現(xiàn)質(zhì)量問題，能否定性、定量的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)食品中的芝麻、花生、豌豆成分，對(duì)于確保食品質(zhì)量，保證人們健康飲食有著至關(guān)重要的作用

2、。
　　本試驗(yàn)通過對(duì)芝麻（Sesamum indicum）的2S albumin-like序列、花生(Arachis hypogaea)的主要致敏基因(Arah1gene)以及豌豆(Pisum sativum)葉綠體中隔離HS878的tRNA-Leu(trnL)基因和trnL-trnF序列基因的間隔區(qū)（trnL-trnF intergenic spacer,partial sequence）特異性序列的分析，設(shè)計(jì)出芝麻、花生的定性

3、PCR引物及實(shí)時(shí)熒光PCR引物以及豌豆的定性PCR引物。通過對(duì)引物的特異性、最適反應(yīng)濃度和最適退火溫度進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，建立物種特異性PCR檢測(cè)方法。進(jìn)一步對(duì)方法的靈敏度、檢出限和對(duì)市售樣品的適用性進(jìn)行測(cè)試。
　　(1)建立了芝麻物種特異性定性PCR檢測(cè)方法及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。試驗(yàn)證明，芝麻物種特異性定性PCR檢測(cè)方法所設(shè)計(jì)篩選的引物sesame-1F/1R物種特異性良好，在優(yōu)化后的擴(kuò)增條件下能夠檢測(cè)出芝麻質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％

4、(50ng/μL)的樣品，應(yīng)用于芝麻加工品檢測(cè)，結(jié)果可信。試驗(yàn)證明，芝麻物種特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法所設(shè)計(jì)篩選的引物、探針sesameQ1-F/R/P物種特異性良好。擴(kuò)增條件經(jīng)優(yōu)化后，建立了Ct值與芝麻DNA的質(zhì)量之間的量化關(guān)系方程式y(tǒng)=-3.38x+30.928，R2=0.997，擴(kuò)增效率E％為97.625％,據(jù)此計(jì)算得到其最低檢出限可至2.7×104copies的芝麻DNA。通過對(duì)市售樣品的檢測(cè)證明了所建立方法的適用性及可行性。

5、
　　(2)建立了花生物種特異性定性PCR檢測(cè)方法及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。結(jié)果證明，花生物種特異性定性PCR檢測(cè)方法所設(shè)計(jì)篩選的引物peanut F/R物種特異性良好，在優(yōu)化后的擴(kuò)增條件下能夠檢測(cè)出花生質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％(50ng/μL)的樣品，可用于加工品檢測(cè)且結(jié)果可靠;試驗(yàn)證明，花生物種特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法所設(shè)計(jì)篩選的引物、探針peanutQ2-F/R/P物種特異性良好，在優(yōu)化后的擴(kuò)增條件下其最低檢出限可至88.98

6、copies的花生DNA。為了對(duì)花生DNA進(jìn)行定量檢測(cè)而進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，其方程為:y=-3.382x+28.267，R2=0.991，擴(kuò)增效率E％為97.5％，并用已知含量的混樣對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行驗(yàn)證。通過對(duì)市售樣品的檢測(cè)證明了所建立方法的適用性及可行性。
　　(3)建立了豌豆物種特異性定性PCR檢測(cè)方法。該方法所設(shè)計(jì)篩選的引物pease-F/R物種特異性良好，在優(yōu)化后的擴(kuò)增條件下能夠檢測(cè)出花生質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％(50ng/μL)的樣

7、品。結(jié)果表明用該方法對(duì)豌豆加工品的檢測(cè)結(jié)果可信。
　　根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，得到如下結(jié)論:
　　1.對(duì)芝麻、花生以及豌豆的定性檢測(cè)研究表明，所建立的體系特異性好，靈敏度高，可滿足對(duì)不同市售食品中目標(biāo)物種的定性檢測(cè)需要，可用于鑒別相關(guān)食品成分及鑒定食品標(biāo)簽的真?zhèn)巍?br>　　2.芝麻、花生的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)研究顯示，針對(duì)單拷貝基因所設(shè)計(jì)的引物探針體系特異性高，能滿足定量檢測(cè)要求。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，算得所檢測(cè)樣品DNA中目的物種含量