豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)試劑盒的研制與應(yīng)用.pdf

1、為了在我國(guó)建立特異、敏感、快速的CSFV診斷技術(shù)，為CSF的凈化和控制提供有力的技術(shù)手段。本研究將熒光定量PCR(FQ一PCR)技術(shù)與ABI定量檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，根據(jù)GenBank下載的29條豬瘟病毒(CSFV)全長(zhǎng)序列、18條牛病毒性腹瀉病病毒一I(BVDV-I)和6條BVDV-II全序列進(jìn)行綜合比對(duì)，為保證CSFV熒光探針的特異性，避開與BVDV同源部分，設(shè)計(jì)了5組CSFV的特異性探針和引物；采用SM、HCLV細(xì)胞毒和GDZl／95、

2、HeBHHl／95、BJCYl／96、JLl／94陽性CSF血毒樣品篩選了最佳探針和引物，優(yōu)化了反轉(zhuǎn)錄酶用量、上下游引物濃度和探針濃度等反應(yīng)試劑，建立了FQ-PCR檢測(cè)CSFV的試驗(yàn)體系；通過體外轉(zhuǎn)錄制備了介于5'-UTR與NPrO之間的非感染性RNA標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)核酸蛋白紫外分析儀測(cè)定RNA純度較高(0D260／0D280一1．9345)，建立的CT值與模板起始濃度對(duì)數(shù)之間的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為r=0．999，斜率為一3．412，并將

3、系列稀釋的CSFVRNA標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)重復(fù)測(cè)定證實(shí)批內(nèi)和批間重復(fù)性均較好，變異系數(shù)分別為O．66-4．42％和0．77-4．19％；在其它病原體的特異性試驗(yàn)中，其它病原的檢出率均為零，說明該方法具有很強(qiáng)的CSFV特異性；在敏感度符合試驗(yàn)方面，與CSF免疫熒光試驗(yàn)(HCFA)符合率為88％，且比HCFA方法更敏感，較RT-nPCR方法敏感100倍；分別采用分三次合成、經(jīng)相應(yīng)檢驗(yàn)合格的引物和探針及其他試劑按優(yōu)化后反應(yīng)體系的要求配制成三批CSFVF

4、Q-PCR試劑，編號(hào)為20051001、20051002、20051003，進(jìn)行可重復(fù)性試驗(yàn)和為期lO個(gè)月的穩(wěn)定性試驗(yàn)，綜合評(píng)價(jià)了CSFVFQ-PCR檢測(cè)方法的多項(xiàng)指標(biāo)，并進(jìn)行了試劑盒組裝，成功研制了特異、靈敏、快速的CSFVFQ-PCR實(shí)驗(yàn)室診斷試劑盒。本試劑盒與進(jìn)口試劑Ready-To-GoRT-PCRBeads和常規(guī)RT-nPCR相比，從反應(yīng)時(shí)間、CT值表現(xiàn)、熒光增幅和試驗(yàn)成本等多方面都體現(xiàn)了FQ-PCR檢測(cè)CSFV的優(yōu)越性。

5、 采用研制的CSFVFQ一PCR試劑盒與HCFA或病毒分離檢測(cè)方法對(duì)我國(guó)19個(gè)省市自治區(qū)的61個(gè)采樣點(diǎn)187份可疑CSF組織病料進(jìn)行臨床應(yīng)用符合試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示CSFVFQ一PCR技術(shù)對(duì)所有組織病料的陽性檢出率為50．80％，HCFA的陽性率為41．27％，差異極顯著(t：3．643，p<0．01)，且FQ一PCR與HCFA間的符合率為86．24％。將CSFVFQ-PCR檢出為陽性，同時(shí)HCFA為陰性的樣品，采用RT-nPCRE2

6、基因全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證，證實(shí)了實(shí)時(shí)CSFVFQ一PCR試劑盒對(duì)于田間樣品CSF病原的診斷具有快速、準(zhǔn)確和敏感的特性。 為了對(duì)HCLV生產(chǎn)進(jìn)行全程量化質(zhì)量監(jiān)控，將CSFVFQ-PCR技術(shù)應(yīng)用于HCLV疫苗細(xì)胞培養(yǎng)液半成品的效力檢驗(yàn)，分別對(duì)3個(gè)批次，總共13次收的疫苗原液和5、10、15、20、25萬倍稀釋液，同時(shí)用兔體定型熱反應(yīng)和FQ-PCR進(jìn)行檢測(cè)，比較并確立兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果問的相關(guān)性，即兩只兔子均為定型熱反應(yīng)的CT值范圍為26．