茶氨酸生物合成基因工程菌發(fā)酵工藝的研究.pdf

1、對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存的具有茶氨酸生物合成能力的基因工程菌pET32a-GGT進(jìn)行了小試發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化；重組質(zhì)粒pET-GGT穩(wěn)定性的鑒定；細(xì)胞固定化生物合成茶氨酸的研究；在30L發(fā)酵罐擴(kuò)大生產(chǎn)工藝的初步研究。主要研究結(jié)果如下： 1、利用Piackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法進(jìn)行了小試發(fā)酵的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：優(yōu)化培養(yǎng)基為葡萄糖10.39g/L、酵母提取物6.88g/L、K2HPO47.10g/L、蛋白胨10g/L、N

2、aCl10g/L、MgSO4·7H2O1g/L；優(yōu)化培養(yǎng)條件為初始pH7.32、培養(yǎng)時(shí)間6.67h、IPTG誘導(dǎo)溫度31.51℃、裝液量50mL/250mL、接種量1％、IPTG誘導(dǎo)時(shí)間4h。γ-GGT活性為4.64U/mL，茶氨酸的產(chǎn)量為35.18g/L，L-谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率為57.7％。 2、該基因工程菌在連續(xù)傳代100代后，質(zhì)粒的目的基因片斷沒(méi)有缺失，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；但在無(wú)抗生素選擇壓力下，連續(xù)傳代20代后開始出現(xiàn)質(zhì)粒丟失

3、的細(xì)胞，連續(xù)傳代100代后18％的細(xì)胞含有正常質(zhì)粒，表現(xiàn)出一定的分裂不穩(wěn)定性。該基因工程菌在優(yōu)化培養(yǎng)基和優(yōu)化條件下的整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，始終表現(xiàn)出良好的結(jié)構(gòu)和分裂穩(wěn)定性。 3、確定了海藻酸鈉(20g/L)固定化后0.05％戊二醛交聯(lián)的固定化方法，固定化細(xì)胞酶活回收率為79.2％。細(xì)胞經(jīng)固定化后操作穩(wěn)定性與貯存穩(wěn)定性較游離菌顯著提高。構(gòu)建了固定化細(xì)胞填充床反應(yīng)器，茶氨酸連續(xù)生物合成的平均產(chǎn)量為25.40g/L，平均體積產(chǎn)率為6.35g

4、/L/h。 4、初步確立了該基因工程菌發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)的相關(guān)參數(shù)和培養(yǎng)方法：30L發(fā)酵罐中加入12L優(yōu)化培養(yǎng)基，5％的接種量，加消泡劑磷酸丁酯5mL，轉(zhuǎn)速250r/min，37℃發(fā)酵培養(yǎng)，并根據(jù)溶氧變化補(bǔ)料添加葡萄糖，當(dāng)溶氧低于40％補(bǔ)料100mL葡萄塘(10g/L)，滴加5mol/LNaOH控制發(fā)酵pH在7.3左右，6h后用0.05mmol/LIPTG誘導(dǎo)，31.5℃誘導(dǎo)4h。30L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)后該基因工程菌的細(xì)胞密度(OD6