文心蘭離體培養(yǎng)優(yōu)化及轉(zhuǎn)化鐵氧還蛋白基因研究.pdf

1、文心蘭(Oncidium hybridum)為蘭科(Orchidaceae)文心蘭屬植物，被插花界譽(yù)為切花“五美人”之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。文心蘭在栽培過程中極易感染病害，尤其是由歐文氏菌(Erwinia spp)引起的軟腐病(Soft rot)更是文心蘭產(chǎn)業(yè)的毀滅性病害，但至今卻仍無特別有效的防治方法，因此選育抗軟腐病的文心蘭品種是文心蘭育種的重要方向。鐵氧還蛋白（FD）作為一個大的基因家族在植物中普遍存在，現(xiàn)已證實(shí)Fd基因可幫助水

2、稻、煙草、擬南芥以及文心蘭在內(nèi)的許多植物獲得廣譜抗性。本研究以文心蘭‘小櫻桃’為材料，利用蘭花基因組數(shù)據(jù)，通過RT-PCR以及RACE技術(shù)克隆獲得2條文心蘭抗軟腐病相關(guān)的鐵氧還蛋白基因，并通過實(shí)時熒光定量PCR以及轉(zhuǎn)化文心蘭原球莖的研究，對這兩個基因進(jìn)行初步的功能驗(yàn)證。本研究的主要結(jié)果如下：
　　1.文心蘭離體培養(yǎng)優(yōu)化。以文心蘭‘小櫻桃’的PLBs為材料，研究不同添加量的香蕉泥對文心蘭PLBs增殖的影響，結(jié)果表明：以1/2MS+1

3、 g/L活性炭+50 g/L香蕉泥時增殖系數(shù)最高，高達(dá)5.41，且原球莖顏色鮮綠，長勢緊密均一沒有出現(xiàn)分化的情況；研究不同激素種類、激素濃度、自然添加物以及接種量對原球莖分化的影響，結(jié)果表明：1/2MS+50 g/L蘋果泥，接種量為8團(tuán)/瓶分化效果最好，分化率達(dá)到100％?？梢娞砑游飳ξ男奶m‘小櫻桃’的PLBs的分化以及細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用。
　　2.文心蘭OnFd與OnFNR基因的克隆與生物信息學(xué)分析。鐵氧還蛋白已被證實(shí)可

4、以幫助許多植物獲得廣譜抗性，本研究基于蘭花基因網(wǎng)站通過構(gòu)建進(jìn)化樹，得到了7條與Fd基因親緣關(guān)系較近的基因序列，長度分別為244、505、452、616、933、209和270 bp，其中505、452、616以及933這四條基因含有完整的ORF序列。以文心蘭‘小櫻桃’健康與感染軟腐病的植株為材料，通過實(shí)時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)其中有兩條基因在感染軟腐病植株中的相對表達(dá)量呈極顯著上升與下降。因此利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆得到這兩條基

5、因的全長序列，分別命名為OnFd（GenBank登錄號為KX461907）與OnFNR（GenBank登錄號為KX461908）。生物信息學(xué)分析表明：文心蘭OnFd含有一個典型的[2Fe-2S]結(jié)構(gòu)域，而OnFNR卻包含有FAD結(jié)構(gòu)域和NADP+結(jié)構(gòu)域。這兩個基因具有相似的磷酸化位點(diǎn)和空間構(gòu)象等，但理化性質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)差異明顯，推測這兩個基因的功能可能存在差異性。
　　3.文心蘭OnFd與OnFNR基因表達(dá)模式分析。以文心蘭‘小櫻桃

6、’健康植株為材料，利用實(shí)時熒光定量PCR檢測OnFd與OnFNR基因在文心蘭的根、假鱗莖、葉和花中均有表達(dá)。其中OnFd在花中的表達(dá)量最高，說明OnFd可能參與了植株的開花調(diào)控；而OnFNR在根中的表達(dá)量最低，而在葉中的表達(dá)量最高，其表達(dá)量約為根表達(dá)量的100倍，可見，OnFNR屬于光合型的LFNR。通過對文心蘭‘小櫻桃’健康植株進(jìn)行不同激素和非生物脅迫處理，發(fā)現(xiàn)OnFd與OnFNR對IAA、ABA、GA、SA、NaCl以及PEG均有響

7、應(yīng)。在IAA、GA、SA、ABA以及NaCl的處理下OnFNR呈上調(diào)趨勢，只有在PEG的處理下呈下調(diào)趨勢；而OnFd在IAA、SA、ABA、NaCl的處理下呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，在GA和NaCl的處理下表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。無論是外源激素還是非生物脅迫均影響著OnFd與OnFNR的表達(dá)量，而這種影響可能與ROS的積累有著密切的關(guān)系。
　　4.文心蘭OnFd與OnFNR基因在不同感病階段的表達(dá)分析。以感染軟腐病文心蘭‘南茜’植株為材料，進(jìn)行軟

8、腐病病菌分離，通過引物Y1/Y2得到一條與歐文氏桿菌(Erwinia carotovora)果膠酶基因(J03673.1)相似度高達(dá)99%的病原菌DNA序列，說明引起本試驗(yàn)所用文心蘭發(fā)病的主要病原菌為歐文氏桿菌。用所得到的軟腐病病原菌對健康的文心蘭‘小櫻桃’進(jìn)行侵染，并以感染軟腐病后1d、3d、6d、9d、12d以及健康植株的根、假鱗莖、下端葉和上端葉為材料，通過熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，文心蘭感病后各個部位的OnFd表達(dá)量均呈上升趨勢，尤其是

9、接種部位假鱗莖在接種病原菌1 d后表達(dá)量便表現(xiàn)出極顯著上調(diào)，并且在5個感病階段的表達(dá)量是健康植株的2.83~3.98倍。但OnFNR在接種病原菌后上端葉、下端葉以及接種部位假鱗莖的表達(dá)量均呈現(xiàn)下降趨勢，而根卻出現(xiàn)了上調(diào)趨勢，并在第12d達(dá)到最高值，其表達(dá)量約為對照組的4.5倍。因此無論是OnFd還是OnFNR對軟腐病菌均有顯著的響應(yīng)，說明這兩個基因可能在文心蘭響應(yīng)抗軟腐病過程中具有重要作用。
　　5.文心蘭OnFd與OnFNR蛋白

10、的亞細(xì)胞定位分析。在獲得OnFd與OnFNR的全長序列的基礎(chǔ)上，構(gòu)建融合綠色熒光1302-GFP蛋白的表達(dá)載體，并且通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法使其在煙草中異位表達(dá)，觀察蛋白的定位情況。結(jié)果表明：OnFd與OnFNR均定位于葉綠體。
　　6.文心蘭OnFd與OnFNR基因轉(zhuǎn)化文心蘭。構(gòu)建35S:OnFd與35S:OnFNR植物過表達(dá)載體；構(gòu)建以PJM007為中間載體的OnFd RNAi與OnFNR RNAi植物抑制表達(dá)載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

11、將其轉(zhuǎn)入文心蘭原球莖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因PLBs在抗性培養(yǎng)階段生長狀態(tài)不好并且顏色偏黃，但進(jìn)入分化培養(yǎng)后顏色開始變綠并且PLBs的體積較非轉(zhuǎn)基因的大。在過表達(dá)OnFd與OnFNR的PLBs中OnFd與OnFNR的表達(dá)量均呈顯著上升，在抑制OnFd表達(dá)的PLBs中OnFd與OnFNR的表達(dá)量均呈極顯著下降，但在抑制OnFNR表達(dá)的PLBs中OnFNR的表達(dá)量雖呈極顯著下降，而OnFd的表達(dá)量卻顯著提高。用軟腐病菌侵染經(jīng)過人為切傷的轉(zhuǎn)基因PLB

12、s發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)OnFd與OnFNR的PLBs較抑制OnFd與OnFNR表達(dá)的PLBs抗軟腐病能力更強(qiáng)，這可能是因?yàn)樵谶^表達(dá)OnFd與OnFNR的PLBs中OnFd與OnFNR的表達(dá)量均上升了。
　　SOD與鐵氧還蛋白之間有著密切的關(guān)系，因此本試驗(yàn)通過以轉(zhuǎn)基因PLBs為材料，對SOD相關(guān)基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)OnFd與OnFNR的PLBs中，Cu/ZnSOD以及FeSOD的表達(dá)量均出現(xiàn)顯著下調(diào)；當(dāng)抑制OnFd與OnFNR