文心蘭OnAPl-like基因的克隆、表達(dá)分析及轉(zhuǎn)化體系的研究.pdf

1、文心蘭為蘭科(Orchidaceae)文心蘭屬（Oncidium）植物的總稱，又名舞女蘭、跳舞蘭，原產(chǎn)于中南美洲和北美洲南部。其花序分枝性良好，花色亮麗，花形優(yōu)美，具有良好的觀賞價值。近年來隨著分子生物學(xué)在花卉相關(guān)研究以及在育種過程中的應(yīng)用，觀賞植物開花相關(guān)基因及其功能的研究成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，但是對文心蘭開花相關(guān)基因的研究還很少。本研究以文心蘭的花葶為材料，采用RT-PCR和RACE技術(shù)等方法，克隆出了文心蘭的開花相關(guān)基因OnAP1(

2、APETALA1)-like的保守序列及其全長序列開放閱讀框(ORF)的擴(kuò)增，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析;利用qRT-PCR技術(shù)分析該基因在不同時期不同器官的表達(dá)特性，并對文心蘭OnAP1-like基因進(jìn)行了植物表達(dá)載體的構(gòu)建;以及對文心蘭的遺傳轉(zhuǎn)化。主要研究結(jié)果如下:
　　1、文心蘭OnAP1-like基因cDNA全長序列的克隆及序列分析
　　以南茜文心蘭（Oncidium'GowerRamsey'）盛花期花葶提取的總RN

3、A為模板，通過RT-PCR與RACE擴(kuò)增，獲得一個958bp的AP1(APETALA1)-like基因的cDNA全長序列，其基因編碼區(qū)690bp，共編碼氨基酸229個，命名為OnAP1-like（登錄號:KC426946）。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析表明，該蛋白質(zhì)48.91％為α螺旋，10.92％為β折疊，40.17％為無規(guī)則卷曲，為親水性蛋白質(zhì)。蛋白序列比對和進(jìn)化樹分析表明，OnAP1-like蛋白與蕙蘭AP1-like蛋白一致性最高，進(jìn)化距

4、離最近。預(yù)測了該蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。
　　2、文心蘭OnAP1-like基因植物表達(dá)載體pR1101-OnAP1的構(gòu)建
　　將克隆的OnAP1-like基因連接在pMD19-T上構(gòu)建克隆載體pMD19-OnAP1。測序結(jié)果正確的pMD19-OnAP1和質(zhì)粒pRI101ON經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ/SmaⅠ雙酶切后，經(jīng)T4DNA連接酶連接后，構(gòu)建成植物表達(dá)載體pRI101-OnAP1。經(jīng)過菌落篩選、PCR檢測以及雙酶切驗(yàn)證，最終確

5、定文心蘭OnAP1-like基因的植物表達(dá)載體pRI101-OnAP1構(gòu)建成功，為遺傳轉(zhuǎn)化及雜交驗(yàn)證打下基礎(chǔ)。
　　3、采用qRT-PCR技術(shù)對文心蘭OnAP1-like基因進(jìn)行時空表達(dá)分析
　　利用RT-qPCR對從文心蘭不同時期不同器官中的OnAP1-like基因表達(dá)量進(jìn)行分析，用2-ΔΔCt法來計算，結(jié)果表明，同一器官不同發(fā)育時期比較，在葉中，花蕾期的表達(dá)量最高;在根中，隨發(fā)育時間推移，表達(dá)量逐漸升高，至花后期達(dá)到最高