BADH和CMO基因的無選擇標(biāo)記表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米的研究.pdf

1、玉米是重要的糧食和飼料作物，也是現(xiàn)代食品、醫(yī)藥、化學(xué)工業(yè)的重要原料作物，玉米是對鹽分中度敏感的作物，土壤干旱、鹽堿脅迫是降低其產(chǎn)量的主要環(huán)境因素之一，因此，培育耐鹽玉米品種具有重要的意義。采用傳統(tǒng)的育種方法選育抗旱耐鹽品種極為緩慢。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)培育抗逆植物新品種已成為21世紀(jì)農(nóng)業(yè)發(fā)展的一個重要方向。目前，多數(shù)植物的遺傳轉(zhuǎn)化都要使用選擇標(biāo)記基因，諸如抗生素或除草劑抗性基因等來篩選轉(zhuǎn)化子，雖然仍無直接研究結(jié)果表

2、明選擇標(biāo)記基因影響人類健康或環(huán)境安全，但引起了人們對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性的擔(dān)心。為了消除轉(zhuǎn)基因作物的安全性顧慮，無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)運而生。本實驗采用無選擇標(biāo)記的BADH和CMO基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米，為培育出具有安全、高度耐鹽堿的玉米新品種打下良好基礎(chǔ)。 本文采用玉米常用自交系為受體材料，對膽堿單加氧酶基因(CMO)和甜菜堿醛脫氫酶基因(BADH)的無選擇標(biāo)記表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米進(jìn)行了研究，鑒定了玉米愈傷組織及苗耐鹽堿性敏感性，確定玉

3、米愈傷組織及幼苗鹽臨界濃度，對已轉(zhuǎn)化的愈傷組織及幼苗進(jìn)行篩選和幾項重要生理指標(biāo)的鑒定。評價轉(zhuǎn)BADH和CMO基因玉米耐鹽堿的能力。取得的主要研究結(jié)果如下： 1．進(jìn)一步優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米愈傷組織轉(zhuǎn)化條件。 以普通玉米自交系H99和P<,2>的胚性愈傷組織為材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將BADH和CMO基因?qū)胗衩鬃越幌抵?，研究農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化。結(jié)果表明，濃度(OD值)在0.5-0.6左右，侵染25分鐘時的愈傷組織的侵染效

4、果最好，轉(zhuǎn)化率達(dá)到4.0％。 2．利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法把BADH和CMO基因轉(zhuǎn)入玉米，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。 將轉(zhuǎn)化的愈傷組織進(jìn)行分化出苗后進(jìn)行PCR、Southern雜交，證明外源目的基因已整合到玉米基因組中。 3．利用花粉管通道法把BADH和CMO基因轉(zhuǎn)入玉米，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。 采用了花粉管通道法對玉米自交系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。將抗鹽基因轉(zhuǎn)入玉米自交系030、吉農(nóng)201和父本1中，并從中得出花粉管通道法的最佳轉(zhuǎn)化

5、條件。用SSC溶解的質(zhì)粒，導(dǎo)入間隔時間要在8-20小時范圍內(nèi)，并且導(dǎo)入質(zhì)粒的濃度為500μg/mL、導(dǎo)入量為200μl 即可達(dá)3.3％的轉(zhuǎn)化率，通過轉(zhuǎn)化植株后代的PCR、Southern雜交分析，證明了抗鹽基因已整合到受體植株的基因組中，并在后代中得以表現(xiàn)。 4．確定玉米愈傷組織鹽篩選臨界濃度為32mmol/L，幼苗鹽篩選臨界濃度為1.0％。 5．對轉(zhuǎn)BADH和CMO基因幼苗耐鹽性相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)行了鑒定所測的耐鹽性生理指