無載體無選擇標記轉(zhuǎn)基因耐貯藏甜瓜的培育.pdf

1、甜瓜是世界上十大水果之一,河套蜜瓜是內(nèi)蒙古西部河套地區(qū)特產(chǎn)的地方優(yōu)良甜瓜品種,是本地區(qū)主要的經(jīng)濟作物之一。其果實是典型的呼吸躍變型果實,成熟后迅速軟化腐爛,嚴重制約河套蜜瓜生產(chǎn)的發(fā)展。
　　 本論文以河套蜜瓜成熟果實的RNA為模板,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分別克隆得到ACC合成酶1(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACS1)、ACC氧化酶1(1-aminocyclopro

2、pane-1-carboxylic acid oxidase,ACO1)、乙烯受體ETR2和3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme Areductase,HMGR)基因的全長cDNA序列,序列分析表明,各基因cDNA長分別為:ACS11531bp,編碼493個氨基酸；ACO11035bp,編碼318個氨基酸；ETR22304bp,編碼767個氨基酸；HMGR1939b

3、p,編碼588個氨基酸。與已報道的甜瓜各基因cDNA的序列同源性很高,所編碼的蛋白質(zhì)序列完全一致。
　　 應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR技術(shù)對不同發(fā)育階段的甜瓜果實中各基因的表達特性進行了分析。結(jié)果表明,ACS1和ACO1基因的表達從授粉后第30天(dayafter pollination,DAP)起表達量開始增加,40DAP表達量迅速躍變達到最大,之后下降,與15DAP相比,兩者分別增加了60倍和30萬倍的表達量。ETR2基因在

4、15DAP至30DAP表達沒有變化,35DAP表達量開始上升,上升趨勢一直持續(xù)至45DAP,最高表達量為15DAP的9倍。HMGR基因的表達在25DAP有一個峰值,表達量為15DAP的3倍,之后下降,在35DAP表達量又開始回升,到40DAP達到最大值后開始下降,最高表達量為15DAP的16倍。
　　 以植物雙元表達載體pPZP221(GenBank中登錄號:U10491)為構(gòu)建的初始載體,用限制性內(nèi)切酶PmeI和AseI雙酶切

5、去除植物抗性選擇標記慶大霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因aacC1(Gentamycin acetyltransferase gene),并在該位點重新插入CaMV35S啟動子和nos終止子序列,獲得載體pPZP201(35S-nos)。分別將ACS1基因cDNA編碼區(qū)的588bp和ACO1基因cDNA編碼區(qū)的710bp片段反向構(gòu)建到pPZP201(35S-nos)載體,命名為pPZP201-ACS1和pPZP201-ACO1。用限制性內(nèi)切酶PsyⅠ

6、和PaeⅠ雙酶切載體pPZP201-ACS1和pPZP201-ACO1,獲得無載體骨架序列無選擇標記基因的長約2.3kb的RB-35S-反向目的片段-nos-LB線性表達盒。
　　 采用花粉管通道法將構(gòu)建好的各基因的線性表達盒導(dǎo)入河套蜜瓜,獲得大量轉(zhuǎn)化種子。PCR檢測證明外源基因已經(jīng)整合到受體植物的基因組中,經(jīng)表型篩選證實,已經(jīng)獲得了耐貯性強的T2代轉(zhuǎn)反義ACS1和反義ACO1基因株系。經(jīng)RT-PCR檢測證明反義ACO1基因已經(jīng)

7、在轉(zhuǎn)基因果實中表達。T2代轉(zhuǎn)反義ACS1和反義ACO1基因果實的乙烯含量分別為對照果實乙烯合成量的7％和5％左右,轉(zhuǎn)基因果實在常溫下貯藏30天時,果實硬度基本保持不變,果實不過熟、不霉變。而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ展麑嵲?2天內(nèi)已經(jīng)軟化腐爛。對T2代轉(zhuǎn)反義ACO1基因甜瓜花特性的研究表明,轉(zhuǎn)基因甜瓜與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ仗鸸显诨ǚ坌螒B(tài)、花粉萌發(fā)特性上無明顯差異。轉(zhuǎn)基因甜瓜兩性花著生節(jié)位(第11節(jié))高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ仗鸸蟽尚曰ㄖ?jié)位(第8節(jié))。轉(zhuǎn)基因甜瓜花梗