基于納米金新型檢測系統(tǒng)的臨床病原微生物快速檢測芯片的研制.pdf

1、病原體的快速檢測和鑒定對于感染性疾病的診斷和治療具有重要的意義。近年來由臨床標本中分離的細菌以地區(qū)不同而有所不同，但普遍以腸桿菌，葡萄球菌，克雷伯菌，變形桿菌，沙雷菌，假單胞菌和氣單胞菌等多見，由于大量廣譜抗生素的不合理應用，引起正常菌群失調和耐藥菌株的出現(xiàn)，平常對正常宿主不致病的常居菌引起內源性感染和治療中插入性操作所導致的外源性感染也日益增多。在病原微生物的快速診斷方面，以分子生物學為基礎的細菌鑒定方法主要以微生物的基因為檢測靶標，

2、既能夠克服以微生物表型特征為基礎檢測方法的缺點和影響因素，從根本上對微生物進行鑒別和特征分型，同時能夠大大縮短檢測時間，提高檢測靈敏度和特異性。納米金是指直徑為納米范圍的金顆粒或含金的化合物，它的化學性質穩(wěn)定，可標記蛋白和核酸。同時，它具有與銀反應后形成比原來體積大10<'6>倍的黑色顆粒，可以用肉眼觀察或用普通記錄裝置如照相、掃描記錄的特點，近年來受到了科研人員的重視，特別是用不具備吸附能力離散的納米金作為信號報告分子的應用則是近年生

3、物信號檢測中的一個重要進展。本研究利用通用引物PCR將多個目標菌的待檢基因片段百萬倍的放大，與固定上特異性探針的基因芯片結合，再用巰基作為納米金顆粒與核酸的連接分子，將納米金標記在核酸上作為信號報告分子，旨在利用納米金新型信號系統(tǒng)來達到小成本，高準確性的進行微生物學鑒定的目的。 實驗的主要方法及結果如下： 1．選用了臨床常見及一些強致病性的病原體為目標，完成了各靶病原體特征性核酸標志的確定，并針對16S rDNA 3’端

4、及23S rDNA 5’端的最保守序列，設計了能夠一次性擴增16個菌的通用引物。 2．完成了16個病原體的PCR擴增方法，包括：金黃色葡萄球菌，溶血性葡萄球菌，腐生葡萄球菌，表皮葡萄球菌，肺炎鏈球菌，化膿性鏈球菌，無乳鏈球菌，銅綠假單胞菌，百日咳鮑特菌，淋病雙球菌，肺炎克雷伯菌，枯草芽孢桿菌，洋蔥假單胞菌，醋酸鈣不動桿菌，奇異變形桿菌，洛菲氏不動桿菌，腸球菌，大腸埃希菌等，并對擴增條件進行優(yōu)化，使各擴增反應能在相同的擴增條件下完

5、成。 3．在相同條件下設計了各靶病原體特異性寡核苷酸探針，利用生物信息學方法對探針進行計算機模擬篩選，對探針的特異性、可靠性的指標進行檢測，并確定了雜交條件。結果顯示各探針在G+C含量、發(fā)夾結構、自身二聚體以及重復堿基數(shù)等指標均符合寡核苷酸探針設計要求，所選用探針特異性強，具有相同的雜交條件。 4．將篩選出的檢測探針、陽性對照探針以及陰性探針點在尼龍膜上制成膜芯片，用生物素標記引物后對模板DNA進行擴增，雜交方法為反向斑

6、點膜雜交，顯色方法為DAB法和化學發(fā)光法，實驗結果為相應檢測探針點及陽性對照均有雜交結果，陰性對照、空白對照和其他探針點均無顯影結果，背景清晰，結果可靠。證明本檢測方法準確可靠，可用于各靶序列的檢測。 5．對反向斑點膜雜交的兩種顯色方法進行了比較研究，包括DAB顯色法和化學發(fā)光顯色法，證明前者操作簡便，用時短，后者費時且步驟繁瑣，但在靈敏度上遠遠優(yōu)于前者。 6．在前期實驗的基礎上，對最佳點樣探針濃度的確立進行了研究，結果

7、探針濃度從5nM到3000nM變化時，其顯色強度先迅速增加，在濃度達到500nM后趨于平緩。與靶序列雜交后其雜交點信號強度值在高于1000nM的探針高濃度區(qū)，反而呈下降趨勢。表明點樣探針濃度為500nM時可獲得較好的固定率和雜交效率，因此將制備芯片的探針濃度確定為500nM。 7．對銀染反應的時間和條件進行了比較研究，證實25℃，5min×5的反應方式能獲得較穩(wěn)定的顯色效果。 8．臨床樣品的檢測結果顯示，陽性探針點及陽性

8、對照點均有顯色結果，陰性對照、空白對照和其他探針點均無顯影結果，背景清晰，結果可靠。檢測結果與常規(guī)經(jīng)典檢測鑒定方法結果一致，證明本檢測方法準確可靠，可用于臨床樣品的檢測。 9．對以下兩種納米金標記方法的效率進行了比較性研究：①用巰基修飾引物的PCR擴增產(chǎn)物進行芯片雜交后，與納米金的標記結合效率；②用生物素修飾引物的PCR擴增產(chǎn)物進行芯片雜交后，與納米金標記的抗生物素抗體的結合效率。比較試驗結果為：后者雖然在顯色過程中借助的連接分