miRNA對(duì)腎小管上皮細(xì)胞中膠原沉積和間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控.pdf

1、在高糖和TGF-β等病理性因素誘導(dǎo)下，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生過多的膠原蛋白是造起腎小管間質(zhì)纖維化的重要原因。miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，目前已有研究表明miRNA從多個(gè)環(huán)節(jié)參與調(diào)節(jié)腎臟纖維化，但其機(jī)制不清。
　　 為了開展TIF中miRNA研究，我們利用miRNA芯片技術(shù)平臺(tái)，建立了一種永生化的人PTCs細(xì)胞系-HK-2細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜。為了進(jìn)一步研究這些miRNA功能，我們進(jìn)

2、行了以下兩個(gè)方面的研究，以探討引起PTCs中miRNA紊亂造成TIF新的分子機(jī)制。
　　 第一部分高糖下調(diào)HK-2細(xì)胞中miR-29a增加Ⅳ型膠原表達(dá)
　　 miRNA表達(dá)芯片結(jié)果顯示，高糖處理后有14個(gè)miRNA的表達(dá)量變化超過了30％。在這些miRNA之中，miR-29a表達(dá)量變化最大，而且它也屬于HK-2細(xì)胞中40個(gè)豐度最高的miRNA，因此我們把miR-29a作為下一步研究的對(duì)象。
　　 我們利用real

3、-time PCR和northern blot等方法驗(yàn)證了上述芯片的結(jié)果。兩者的結(jié)果與芯片結(jié)果一致：高糖誘導(dǎo)后miR-29a表達(dá)下調(diào)了40-50％。同時(shí)我們還證實(shí)，TGF-β1同樣可顯著下調(diào)HK-2細(xì)胞中miR-29a的表達(dá)水平。
　　 在糖尿病腎病發(fā)展過程中，Ⅳ型膠原表達(dá)增加是TIF的重要病理特征之一。因此，高糖下調(diào)miR-29a可能引起Ⅳ型膠原增加。首先，我們用western blot的方法證實(shí)高糖可使HK-2細(xì)胞中Ⅳ型膠原

4、表達(dá)顯著升高，表明PTCs中Ⅳ型膠原和miR-29a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。接下來，我們分別在HK-2細(xì)胞中抑制和過表達(dá)miR-29a，結(jié)果顯示miR-29a作為一種抑制分子控制著HK-2細(xì)胞中Ⅳ型膠原表達(dá)水平。最后，報(bào)告基因的結(jié)果證實(shí)，miR-29a直接調(diào)控co14a1和co14a2的表達(dá)，從而發(fā)揮其控制Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)的功能。
　　 第二部分 TGF-β1下調(diào)腎小管上皮細(xì)胞中miR-30促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化
　　 首先，我們用

5、miRNA芯片方法分析了TGF-β1誘導(dǎo)前后，HK-2細(xì)胞中miRNA的表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示，HK-2細(xì)胞中豐度最高的miR-30家族成員miR-30a-e等5個(gè)miRNA下調(diào)約2倍。我們用Real-time PCR的方法驗(yàn)證了芯片結(jié)果，發(fā)現(xiàn)miR-30a-e顯著下調(diào)。接著，我們?cè)趩蝹?cè)輸尿管梗阻(UUO)誘導(dǎo)EMT動(dòng)物模型中驗(yàn)證了miR-30的作用。這樣，我們就從體內(nèi)、體外兩方面的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-30下調(diào)是腎小管間質(zhì)纖維化的顯著特征

6、。
　　 為了探討miR-30下調(diào)對(duì)EMT的調(diào)控作用，我們?cè)贖K-2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染對(duì)照序列和anti-miR-30a-e序列。HK-2細(xì)胞中出現(xiàn)了很多梭形細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)了類似于EMT的形態(tài)變化，western blot結(jié)果E-cadhein的表達(dá)水平下降，而snail和ZEB2的表達(dá)上調(diào)。這表明，下調(diào)miR-30可直接誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　 為了驗(yàn)證miR-30可直接調(diào)控snail，ZEB2，我們構(gòu)建了4個(gè)

7、熒光素酶報(bào)告基因載體分別包含snail和ZEB2的3'UTR中miR-30預(yù)測(cè)序列及其突變序列。結(jié)果顯示，miR-30可分別下調(diào)snail，ZEB2基因3'UTR相應(yīng)位點(diǎn)熒光素酶活性到53％和75％；而其對(duì)應(yīng)的突變序列活性則分別回復(fù)到92％和94％。這說明miR-30是直接調(diào)控snail和ZEB2，造成EMT，進(jìn)而引起腎小管間質(zhì)纖維化。
　　 綜上所述，本課題首次證明了PTCs中miR-29a和miR-30表達(dá)異常能夠引起膠原沉