產(chǎn)抗病毒活性物質(zhì)菌株的誘變育種及發(fā)酵條件研究.pdf

1、病毒感染性疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康，開發(fā)新的抗病毒藥物是治療病毒性疾病的必由之路。本研究是在發(fā)現(xiàn)一株真菌代謝產(chǎn)物有廣譜抗病毒活性的基礎(chǔ)上，對產(chǎn)抗病毒活性物質(zhì)的菌株進(jìn)行誘變育種及發(fā)酵條件的研究。 [目的] 1對產(chǎn)抗病毒活性物質(zhì)菌株進(jìn)行誘變育種，獲得高抗病毒活性的菌株； 2對產(chǎn)抗毒活性物質(zhì)菌株的最適發(fā)酵條件進(jìn)行研究。 [方法] 1 自然選育：將孢子懸液用0.85％的生理鹽水做梯度稀釋，分別選取適當(dāng)稀釋

2、度菌懸液涂布馬鈴薯培養(yǎng)基平板，長出成熟菌落后，挑取單菌落，接種至馬鈴薯培養(yǎng)基斜面上。將挑取的單菌落進(jìn)行液體發(fā)酵，菌絲體提取物做抑毒試驗(yàn)，計(jì)算抑毒指數(shù)，篩選高抗病毒活性的菌株。 2誘變育種 ①紫外線誘變：把孢子懸液加入無菌平皿中，放在紫外燈下照射，然后在紅光燈下進(jìn)行梯度稀釋，挑選適當(dāng)?shù)南♂尪韧坎计桨?。長出成熟菌落后，挑取單菌落進(jìn)行液體發(fā)酵，菌絲體提取物做抑毒試驗(yàn)，計(jì)算抑毒指數(shù)，篩選高抗病毒活性的菌株。 ②CO<'6

3、0>誘變：取孢子懸液分裝在螺旋口試管中，用不同劑量的Co<'60>誘變，然后做梯度稀釋，選取適當(dāng)稀釋度涂布平板，待長出成熟菌落后，統(tǒng)計(jì)致死率，并隨機(jī)挑選單菌落進(jìn)行液體發(fā)酵，菌絲體提取物做抑毒試驗(yàn)，同時(shí)計(jì)算抑毒指數(shù)。③硫酸二乙酯誘變：取制備好的孢子懸液10ml，加入1％硫酸二乙酯0.2ml，振蕩一定時(shí)間后，加入25％硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。然后取誘變孢子懸液做梯度稀釋，待長出成熟菌落后，統(tǒng)計(jì)致死率，并隨機(jī)挑選單菌落進(jìn)行液體發(fā)酵，菌絲體提取

4、物做抑毒試驗(yàn)，同時(shí)計(jì)算抑毒指數(shù)。 ④紫外+氯化鋰復(fù)合誘變：吸取紫外線照射后的孢子懸液接種到含0.5％氯化鋰的馬鈴薯培養(yǎng)基平板上，涂布平皿。至長出成熟菌落，同時(shí)統(tǒng)計(jì)致死率，并隨機(jī)挑選單菌落進(jìn)行液體發(fā)酵，菌絲體提取物做抑毒試驗(yàn)，同時(shí)計(jì)算抑毒指數(shù)。 3培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化①發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)：利用L<,9>(3<'4>)正交表，對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)。 ②發(fā)酵條件的優(yōu)化：以抑毒試驗(yàn)作為測活依據(jù)，對菌株

5、發(fā)酵的最適周期、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基裝量、起始pH及接種量進(jìn)行優(yōu)化研究。 [結(jié)果] 1自然選育：挑選自然選育的單菌落50株，經(jīng)初篩、復(fù)篩沒有篩選到比原菌株抑毒指數(shù)明顯提高的菌株。 2誘變育種 ①紫外線誘變：紫外線誘變得到的30株菌株，經(jīng)初篩、復(fù)篩未篩到比原菌株抑毒指數(shù)明顯提高的菌株。 ②Co<'60>誘變：初篩得到8株正突變菌株，復(fù)篩僅有2菌株具有高抑毒活性。 ③硫酸二乙酯誘變：初篩得到

6、5株正突變菌株，復(fù)篩僅有1菌株具有高抑毒活性。 ④紫外線+氯化鋰誘變：初篩得到9株正突變菌株，復(fù)篩僅有3菌株具有高抑毒活性。 3培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化①發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)：正交試驗(yàn)確定的培養(yǎng)基組成為A<,2>B<,3D<,2>，即馬鈴薯20％，蔗糖2.5％，MgSO<,4> 0.1％，KH<,2>PO<,4> 0.3％。 ②發(fā)酵條件優(yōu)化：論文確定了產(chǎn)抗病毒活性物質(zhì)菌株的最適發(fā)酵條件，即發(fā)酵周期6d，溫

7、度28℃，搖床轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)基裝量300ml/1000ml三角瓶，培養(yǎng)基的起始PH值7.0，接種量為10％。 [結(jié)論] 1 獲取了6株能夠穩(wěn)定產(chǎn)生抗病毒活性物質(zhì)的高產(chǎn)菌株； 2 掌握了紫外線、Co<'60>、硫酸二乙酯及紫外線+氯化鋰四種誘變方法； 3 確定最佳培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯20％，蔗糖2.5％，MgSO<,4> 0.1％，KH<,2>PO<,4>0.3％。 4 確定了菌株發(fā)酵的最適