豬圓環(huán)病毒Ⅱ型全基因組的克隆與序列分析及ORF1基因的原核表達.pdf

1、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(porcine circovirus 2，PCV2)是斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(post-weaning multi-systemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原。它不但可以引起斷奶仔豬衰竭、死亡，還與仔豬A2型先天性震顫(congential tremor type AⅡ，CT)、懷孕母豬流產(chǎn)(reproductive failure)、成年豬皮炎腎炎綜合征(porcine dermatit

2、is and nephropathy, PDNS)和呼吸道疾病綜合征(porcine respiratory disease syndrome，PRDS)有關(guān)。這些疾病的廣泛流行嚴重影響了養(yǎng)豬業(yè)，給世界上養(yǎng)豬國家和地區(qū)帶來巨大損失，更為嚴重的是PCV2還可引起免疫抑制，導(dǎo)致其它病原的混合感染，造成的間接損失難以估計。
　　 本論文的試驗由兩部分組成，一是從疑似病料里一次性克隆得到PCV2的全基因組序列，二是亞克隆PCV2的ORF

3、1基因，并在pET-28a(+)中進行了原核表達。
　　 1.參照國外發(fā)表的豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PCV2)全基因組序列，設(shè)計一對特異性引物，利用該室保存的疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)病料為模板，從中提取PCV2基因組DNA，并以之為模板進行PCR(polymerase chain reaction)擴增。將擴增得到的全基因片斷克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)藍白斑篩選和重組質(zhì)粒PCR鑒定出陽性克隆并進行序列測定與分析，陽性

4、質(zhì)粒命名為PCV2 all。用DNAstar工具將其與GenBank上國內(nèi)外毒株進行了序列比較。結(jié)果表明擴增出了1767bp的片段，序列分析表明與國內(nèi)外毒株核苷酸同源性為高達99.6％。
　　 2.PCV2的ORF1基因是PCV2基因組中最大的一個閱讀框，編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白，也稱為Rep基因。設(shè)計一對特異性引物，以克隆得到的PCV2 all為模板，利用PCR技術(shù)，擴增出了945bp大小的ORF1基因片斷，亞克隆到pMD18-T