豬嵴病毒W(wǎng)UH1株全基因組序列分析及病毒的分離.pdf

1、嵴病毒(Kobuvirus)屬于微小RNA病毒科（Picornaviridae），是一種無囊膜的單股正鏈RNA病毒，可感染人和動物。嵴病毒屬現(xiàn)包含愛知病毒(Aichivirus，AiV)和牛嵴病毒(Bovine kobuvirus，BKV)。2007年，匈牙利學(xué)者在檢測豬杯狀病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)了嵴病毒屬的一個(gè)候選成員—豬嵴病毒(Porcine kobuvirus，PKV)。此后，PKV在歐洲、亞洲和美洲的豬中檢出率都非常高，但其與疾病之間的聯(lián)系

2、尚不清楚。已有報(bào)道愛知病毒會引起人腸胃炎，BKV可能導(dǎo)致牛的腹瀉，并且研究發(fā)現(xiàn)PKV在具有腹瀉癥狀的豬群中陽性率明顯高于無腹瀉癥狀的豬群，這些提示我們PKV也許是引起豬腹瀉的一個(gè)新病原體。
　　 現(xiàn)在已有大量有關(guān)PKV部分核酸序列的報(bào)道，但關(guān)于全基因組的報(bào)道較少，而全基因組的序列分析有助于人們更好地了解不同毒株之間的進(jìn)化關(guān)系。愛知病毒和BKV分別于1991年和2003年被分離到，但目前還沒有分離出PKV病毒粒子，這使得許多關(guān)于P

3、KV的研究不能進(jìn)行。鑒于以上基礎(chǔ)，本研究從豬嵴病毒RT-PCR診斷方法的建立、基因組遺傳進(jìn)化分析和病毒粒子的分離等方面開展了實(shí)驗(yàn)，具體研究內(nèi)容包括:
　　 1.豬嵴病毒RT-PCR檢測方法的建立和應(yīng)用
　　 參考國際上首次報(bào)道的豬kobuvirus/swine/S-1-HUN/2007/Hungary株(GeneBank accession number EU787450)的基因組序列和檢測方法，針對其3D基因設(shè)計(jì)了一對

4、保守序列的PCR引物，引物能特異性擴(kuò)增495 bp的DNA片段。實(shí)驗(yàn)證明該方法特異性良好，敏感性高，重復(fù)性良好。用建立的RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)華中地區(qū)已有較高陽性率的PKV病毒感染，應(yīng)該引起重視。
　　 2.PKV基因組序列的測定和分析
　　 設(shè)計(jì)涵蓋PKV基因組的9對引物，對來自湖北武漢的一份陽性樣品進(jìn)行了全基因組分段擴(kuò)增，5'端采用RACE方法擴(kuò)增，利用DNAStar軟件將序列進(jìn)行拼接，獲得WUH1株全基因組序列。

5、結(jié)果表明，WHU1株基因組全長8210bp，包含一個(gè)開放閱讀框(ORF)，編碼2488個(gè)氨基酸，相對于S-1-HUN/2007/Hungary參考株，WUH1株5'UTR插入一個(gè)堿基，3'UTR缺失一個(gè)堿基而序列總長不變?；谌L基因的進(jìn)化樹分析，我國的PKV流行毒株處在一個(gè)進(jìn)化分支上，而與匈牙利分離株關(guān)系相對較遠(yuǎn)。
　　 3.PKV的分離
　　 將PCR檢測結(jié)果為陽性的樣品處理后接種長滿單層的Vero細(xì)胞并盲傳6代，裂