乙型腦炎病毒prM-E基因的克隆、表達(dá)及prM-E基因、E基因DNA免疫的研究.pdf

1、乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是引起母豬繁殖障礙的主要病因之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)乙型腦炎是一種人畜共患病，是人類中樞系統(tǒng)最常見(jiàn)的蟲(chóng)媒病之一。因此，建立一種安全、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的制備乙腦診斷抗原的方法，尋求穩(wěn)定、安全、新型的乙腦基因工程疫苗已經(jīng)成為當(dāng)今JEV防治的主要研究方向。 本研究以乙型腦炎(JEV)SA14-14-2株全基因作為模板，根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)出兩對(duì)特異性引物，

2、采用RT-PCR技術(shù)人工擴(kuò)增出了JEV SA14-14-2株prM-E、E基因的cDNA。將純化的prM-E基因成功地克隆到puC19載體中，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JMl09感受態(tài)細(xì)胞，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)分子量比較和酶切分析篩選陽(yáng)性克隆。結(jié)果表明，得到的陽(yáng)性重組子(pUC19-prME)中含有prM-E基因，并且正確插入到載體中。將prM-E基因克隆到PET32a(+)載體上，得到的轉(zhuǎn)化予經(jīng)酶切分析，篩選出符合閱讀框的重組子，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒P

3、ET-prME，再將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌BL21(DE3)，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)出約為89KDa、53KDa和36KDa的三條蛋白帶。經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western-blotting檢測(cè)證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物具有免疫學(xué)活性，這為制備乙腦特異性抗原奠定了基礎(chǔ)。 作者將prM-E、E基因克隆到pcDNA3.1(+)載體上，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)酶切分析，篩選出符合閱讀框的重組子，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA-prME和pcDNA-E。將構(gòu)建好

4、的重組質(zhì)粒對(duì)Balb/c鼠進(jìn)行：DNA免疫：每組5只、4周齡、雌性Balb/c鼠共4組，分別將溶于50μL滅菌PBS溶液的不同免疫原肌注于不同組鼠的左后肢，具體包括pcDNA-prME，pcDNA-E，pcDNA 3.1各50μg，單純PBS 50μL，共免疫2次，間隔2周。二次免疫兩周后，各試驗(yàn)組小鼠(5/5)健康存活。分別采集各組小鼠的血，并分離血清，利用中和試驗(yàn)對(duì)抗體進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。結(jié)果是pcDNA-PRME、pcDNA-E免疫組的