登革病毒prM-E基因的多價重組質(zhì)粒DNA的免疫原性研究.pdf

1、該研究利用雙順反子表達載體pIRES構(gòu)建含登革病毒prM-E基因的雙價和四價重組質(zhì)粒DNA,并在小鼠中觀察其免疫原性,為登革多價DNA疫苗的研究提供依據(jù).首先,我們構(gòu)建了含登革1和3型病毒prM-E基因的雙順反子重組質(zhì)粒DNA.利用Trizol試劑從感染DEN1和DEN3的乳鼠腦中提取病毒RNA,然后分別進行RT-PCR,得到DEN1和DEN3 prM-E基因.為提高質(zhì)粒DNA的免疫原性,我們將含鼠源GM-CSF的質(zhì)粒pUMCV1-mG

2、M-CSF與pME1-IRES-ME3和pME2-IRES-ME4進行聯(lián)合免疫.接種途徑采用肌肉多點注射,并在注射后立即對注射部位進行電刺激,以提高DNA的攝入效率.為進一步提高重組質(zhì)粒DNA的免疫原性,擬利用重組的病毒蛋白對小鼠進行加強免疫,以提高中和抗體水平及其持續(xù)的時間.為此,在大腸桿菌中對登革2型病毒包膜蛋白的B區(qū)(298~400氨基酸)進行了表達.我們采用pBAD/TopoThioFusion原核表達載體,結(jié)果顯示,表達產(chǎn)物以

3、可溶性為主,并且表達量約占細菌可溶性總蛋白的62﹪.除了利用雙順反子載體構(gòu)建登革多價疫苗外,該研究還嘗試利用DNA改組技術(shù)構(gòu)建登革病毒的四價疫苗.由于DEN1~4病毒包膜基因的同源性只有60﹪左右,這給DNA改組帶來了極大的困難.DNA改組的關(guān)鍵是建立特異、高通量的篩選平臺,為此我們建立了DNA改組的篩選平臺.我們分別在原核(大腸桿菌)和真核(酵母)表達系統(tǒng)中對DEN2包膜基因進行了表達.缺乏合適的動物模型是登革疫苗研究的一大障礙.為觀

4、察重組質(zhì)粒DNA對動物的保護作用,我們先建立了登革病毒的小鼠模型.對不同品系(Balb/c和C3H)、不同周齡(4和6周齡)的小鼠,以不同的途徑(顱內(nèi)和尾靜脈)接種DEN1~4病毒.結(jié)果顯示,4周齡和6周齡的Balb/c(顱內(nèi)接種)對DEN2較為敏感(死亡率分別為50﹪和12.5﹪),對DEN1、DEN3和DEN4則不敏感.4周齡的C3H顱內(nèi)接種DEN1~4后,均可發(fā)病,死亡率分別為12.5﹪、44.4﹪、25﹪和20﹪,同時小鼠體重增