表達(dá)水泡性口炎病毒G蛋白重組腺病毒的構(gòu)建與免疫原性分析.pdf

1、水泡性口炎(Vesicular stomatitis，VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV))引起的高度接觸性人畜共患的重大傳染性疫病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定通報(bào)傳染病，也是《中華人民共和國進(jìn)出境動(dòng)植物檢疫法》規(guī)定的進(jìn)境動(dòng)物二類傳染病。目前，該病還沒有有效的治療方法，只能通過疫苗進(jìn)行防控。在疫苗研究方面，國內(nèi)外已有一些研究，但新型疫苗的研究有待進(jìn)一步開發(fā)。
　　VS

2、V糖蛋白(G)定位在包膜的突起上，刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，呈現(xiàn)型乃至株的特異性，是研究VSV基因工程疫苗的首選抗原。本研究利用人5型復(fù)制缺陷型腺病毒為表達(dá)載體，構(gòu)建了表達(dá)VSV單一血清型的G蛋白及兩血清型G蛋白融合蛋白的重組腺病毒，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了初步分析。本研究設(shè)計(jì)了三對(duì)分別擴(kuò)增VSV-IN-G、VSV-NJ-G及VSV-IN-G-NJ-G基因的特異性引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增VSV-IN-G基因及VSV-NJ-G基因;通過GlyGl

3、yGlyGlySer多肽序列的連接，利用融合PCR技術(shù)擴(kuò)增VSV-IN-G-NJ-G基因。將三個(gè)目的基因分別克隆至腺病毒穿梭載體pacAd-CMV K-NpA中，構(gòu)建含有目的基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒。利用PCR鑒定、雙酶切鑒定及測(cè)序鑒定篩選陽性重組質(zhì)粒。將鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒分別用PacⅠ酶線性化后，與同樣用PacⅠ酶線性化的骨架載體pacAd59.2-100共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，成功包裝出了三株重組腺病毒rAd-VSV-NJ-G

4、，rAd-VSV-IN-G及rAd-VSV-IN-G-NJ-G。將三種重組腺病毒分別接種于AAV-293細(xì)胞，連續(xù)傳代至20代，測(cè)定其TCID50，效價(jià)均穩(wěn)定。利用間接免疫熒光和western blot檢測(cè)方法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示G蛋白在重組腺病毒中均可以正確表達(dá)，且具有良好的反應(yīng)原性。
　　為了評(píng)價(jià)三株重組腺病毒的免疫效果，本研究選取50只6～8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為5組，每組10只。將三株重組腺病毒分別以2

5、周為間隔，肌肉注射及皮下注射接種小鼠3次。于首次接種后0，2，4，6周采集血液分離血清，利用間接ELISA檢測(cè)VSV特異性抗體水平，結(jié)果顯示均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生VSV特異性抗體。以病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)中和抗體水平，其中和抗體水平均在1∶16～1∶32之間。利用淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞免疫水平，結(jié)果表明均可以引起接種小鼠強(qiáng)烈的淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)，且明顯高于陰性對(duì)照組。以上結(jié)果表明，所構(gòu)建的三株重組腺病毒可以很好地表達(dá)目的蛋白，接種小鼠可以引起一定的