表達小反芻獸疫病毒H、F蛋白的重組山羊痘病毒的構(gòu)建及免疫原性研究.pdf

1、小反芻獸疫（Peste des petits of ruminants，PPR）是由小反芻獸疫病毒（Pestedes petits of ruminants virus，PPRV）引起的危害山羊、綿羊等小反芻動物的重大疫病，為世界動物衛(wèi)生組織（The World Organisation for Animal Health）發(fā)布的A類烈性傳染病之一。近年來，PPR在我國周邊國家和地區(qū)及我國西藏自治區(qū)的肆虐對我國的養(yǎng)羊業(yè)構(gòu)成嚴重的威脅。<

2、br>　　 目前，我國西藏和新疆等西部地區(qū)采用經(jīng)Vero細胞傳代弱化的PPRV弱毒疫苗來預防PPR。但是，弱毒疫苗免疫小反芻獸之后無法與野毒感染相區(qū)別，不利于對PPR_的血清學監(jiān)控，更重要的是，PPRV弱毒疫苗熱敏感性強，限制了其在熱帶地區(qū)的應用。由于山羊痘（Goat pox，GP）與PPR宿主范圍一致，地理分布區(qū)域類似，GPV弱毒疫苗具有較強的熱穩(wěn)定性，并且隨著DNA重組技術的發(fā)展，山羊痘病毒（Goat pox virus，GPV）

3、在做為疫苗載體方面顯示出很強的優(yōu)越性，國外已有將PPRV保護性抗原基因F/H插入山羊痘病毒疫苗載體構(gòu)建二重疫苗進行免疫學研究的報道，并且顯示了良好的應用前景，但在國內(nèi)尚未見相關的報道。本研究將利用我國自行培育并得到廣泛應用的GPV弱毒株，分別構(gòu)建表達PPRV囊膜蛋白F和H的重組山羊痘病毒，并對其免疫原性進行了初步評估。
　　 試驗一、小反芻獸疫重組山羊痘病毒的構(gòu)建。首先在已有載體pTK-gpt-gfp的基礎上，構(gòu)建了痘病毒晚期啟

4、動子p11驅(qū)動的、內(nèi)部核糖體進入位點（ires）介導的黃嘌呤鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（gpt）和綠熒光蛋白基因（egfp）串聯(lián)表達的轉(zhuǎn)移載體pTK-gpt-ires-egfp，將PPRV保護性抗原H、F基因片段分別克隆至pTK-gpt-ires-egfp，SalⅠ位點，獲得載體質(zhì)粒pTK-gig-PPRV-H、pTK-gig-PPRV-F；以我國自行培養(yǎng)并得到廣泛應用的山羊痘病毒（GPV）疫苗株為親本病毒，以山羊痘病毒（GPV）的復制非必需

5、區(qū)TK基因為靶點，通過質(zhì)粒pTK-gig-PPRV-H、pTK-gig-PPRV-F與GPV的同源重組，霉酚酸（Mycophenolic acid，MPA）藥物篩選，病毒蝕斑單克隆化后獲得完全純化的重組病毒rGPV-PPRV-F和rGPV-PPRV-H。以F、H基因的特異性引物PCR鑒定，表明基因片段分別在重組病毒中正確整合；經(jīng)Western-blot和IFA（間接免疫熒光）方法證實H蛋白、F蛋白分別在重組病毒中穩(wěn)定表達。
　　

6、 試驗二、rGPV-PPRV-F、rGPV-PPRV-H重組病毒的初步免疫研究。以2×10。PFU的rGPV-PPRV-F、rGPV-PPRV-H皮內(nèi)注射免疫山羊，一免后第28天進行加強免疫，采血分離血清進行病毒中和試驗。結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的小反芻獸疫重組山羊痘病毒rGPV-PPRV-H、rGPV-PPRV-F一次免疫山羊，3周后PPRV中和抗體轉(zhuǎn)陽率可達100％（6/6）、100％（3/3），二免后PPRV中和抗體效價進一步得到增強