新城疫病毒La Sota株F和HN基因的克隆表達(dá)及免疫原性分析.pdf

1、新城疫是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一。近年來(lái)，新城疫的爆發(fā)出現(xiàn)了許多新特點(diǎn)，免疫失敗報(bào)道增多，甚至抗體水平較高的雞群也時(shí)常發(fā)病。為控制新城疫的爆發(fā)，急需研制基因工程苗。 以本實(shí)驗(yàn)室保存的NDVLaSota株全基因作為模板，根據(jù)Genbank已經(jīng)發(fā)表的序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，采用RT-PCR技術(shù)人工擴(kuò)增出了NDVLaSota株F、HN基因，分別將其克隆到PGEM-Teasy載體中，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)分子量比較、

2、PCR鑒定和酶切分析篩選陽(yáng)性克隆。結(jié)果表明，作者得到的陽(yáng)性重組子(PGEM-F、PGEM-HN)中含有F和HN基因，且是正確插入到載體中的。F基因的測(cè)序結(jié)果與B1、V4、Roakin、JS06、F48E9毒株的基因序列相比，核苷酸序列同源性為84.7﹪-99.9﹪,氨基酸同源性為88.1﹪-99.6﹪；HN基因的測(cè)序結(jié)果與B1、V4、Roakin、YG、F48E9毒株相比，核苷酸序列同源性為82.5﹪-99.6﹪,氨基酸同源性為88.1

3、﹪-99.9﹪。 然后將克隆化F、HN基因亞克隆到PET-32a(+)載體上，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR鑒定和酶切分析，篩選出符合閱讀框的重組子，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒PET-F、PET-HN，再將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌BL21(DE3)，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)出約為83kd和86kd的融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western-blotting檢測(cè)證實(shí)上述兩段基因片段均獲得高效表達(dá)且表達(dá)產(chǎn)物具有免疫學(xué)活性。 在優(yōu)化了表達(dá)條