轉(zhuǎn)基因克隆牛胎盤表達(dá)譜分析及定量PCR驗證.pdf

1、體細(xì)胞核移植技術(shù)常被用作轉(zhuǎn)基因平臺生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，在所有克隆物種里，牛的克隆妊娠成功率最高，但也不超過自然妊娠或人工授精成功率10％。已有研究證實胎盤發(fā)育異常是導(dǎo)致克隆動物妊娠成功率低的一個主要原因，因此探明克隆牛胎盤發(fā)育異常機理的研究就顯得尤為重要，通過分析其表達(dá)譜可獲得全面的基因表達(dá)信息，可為解決克隆牛胎盤異常發(fā)育提供分子理論基礎(chǔ)。
　　本研究以兩組相同處理的轉(zhuǎn)基因克隆牛胎盤和一組自然妊娠牛胎盤為研究對象，通過二代測序技術(shù)對三

2、組材料進行了轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq），得到的結(jié)果通過了RPKM列標(biāo)準(zhǔn)化處理和功能聚類分析（GO和KEGG Pathway），結(jié)果顯示上調(diào)差異表達(dá)基因主要與細(xì)胞粘附、胞外基質(zhì)功能相關(guān)，下調(diào)差異表達(dá)基因主要與免疫活動有關(guān)。這提示本研究所使用的轉(zhuǎn)基因克隆牛出現(xiàn)了異常，功能細(xì)胞遷移受阻，使母胎對話不通暢，影響胎兒正常發(fā)育。另外，下調(diào)基因與免疫相關(guān)提示本研究，轉(zhuǎn)基因克隆牛胎盤較正常牛胎盤免疫力低下，很可能遭受病原體感染。
　　由于RNA

3、-Seq分析差異表達(dá)基因時沒有內(nèi)部參照，可能出現(xiàn)假陽性錯誤，因此本研究通過定量 PCR驗證，根據(jù)定量結(jié)果和測序結(jié)果的一致性判斷測序結(jié)果的準(zhǔn)確程度。但是對全部差異表達(dá)基因都進行定量 PCR檢測是不現(xiàn)實的，所以需要人為篩選。本研究以信號通路結(jié)果為主線，參考GO結(jié)果和基因網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系，并考慮個別特殊基因，篩選了30個基因進行定量驗證。驗證結(jié)果顯示，超過80%的關(guān)鍵基因在定量結(jié)果和測序結(jié)果中保持一致，說明本次測序準(zhǔn)確度非常好。同時，本研究設(shè)計的