利用實時定量pcr和ct法分析基因相對表達量

1、利用實時定量利用實時定量PCRPCR和2－△△CT△△CT法分析基因相對表達量法分析基因相對表達量METHODS25402–408(2001)AnalysisAnalysisofofRelativeRelativeGeneGeneExpressionExpressionDataDataUsingUsingRealTimeRealTimeQuantitativeQuantitativePCRPCRthethe2－△△CT△△CTMetho

2、dMethodKenhJ.LivakThomasD.Schmittgen1AppliedBiosystemsFosterCityCalifnia94404DepartmentofPharmaceuticalSciencesCollegeofPharmacyWashingtonStateUniversityPullmanWashington991646534摘要：摘要：現在最常用的兩種分析實時定量PCR實驗數據的方法是絕對定量和相對定量。

3、絕對定量通過標準曲線計算起始模板的拷貝數；相對定量方法則是比較經過處理的樣品和未經處理的樣品目標轉錄本之間的表達差異。2－△△CT方法是實時定量PCR實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法，即相對定量的一種簡便方法。本文介紹了該方法的推導，假設及其應用。另外，在本文中我們還介紹了兩種2－△△CT衍生方法的推導和應用，它們在實時定量PCR數據分析中可能會被用到。關鍵詞：關鍵詞：反轉錄PCR定量PCR相對定量實時PCRTaqman反轉錄P

4、CR（RTPCR）是基因表達定量非常有用的一種方法（13）。實時PCR技術和RTPCR的結合產生了反轉錄定量PCR技術（45）。實時定量PCR的數據分析方法有兩種：絕對定量和相對定量。絕對定量一般通過定量標準曲線來確定我們所感興趣的轉錄本的拷貝數；相對定量方法則是用來確定經過不同處理的樣品目標轉錄本之間的表達差異或是目標轉錄本在不同時相的表達差異。絕對定量通常在需要確定轉錄本絕對拷貝數的條件下使用。通過實時PCR進行絕對定量已有多篇報道

5、（69），包括已發(fā)表的兩篇研究論文（1011）。在有些情況下，并不需要對轉錄本進行絕對定量，只需要給出相對基因表達差異即可。顯然，我們說X基因在經過某種處理後表達量增加2.5倍比說該基因的表達從1000拷貝細胞增加到2500拷貝細胞更加直觀。用實時PCR對基因表達進行相對定量分析需要特殊的公式、假設以及對這些假設的驗證。2－△△CT方法可用于定量PCR實驗來計算基因表達的相對變化：2－△△CT公式的推導，以及實驗設計，有效性評估在App

6、liedBiosystemsUserXN代表經過均一化處理過的初始目標分子量；△CT表示目標基因和內標基因CT值的差異（CTX－CTR）整理上式得：最后用任一樣本q的XN除以參照因子（calibratcb）的XN得到：在這里對于一個少于150bp的擴增片斷而言，如果Mg2濃度、引物都進行了適當的優(yōu)化，擴增效率接近于1。因此目標序列的量通過內均一化處理之后相對于參照因子而言就是1.2.1.2.2－△△CT△△CT方法的假設和應用方法的假設