肺炎支原體感染相關(guān)致病機(jī)制及分子診斷研究.pdf

1、第一部分肺炎支原體感染相關(guān)致病機(jī)制研究
　　背景：
　　肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae，MP)是Eatton等首次于1944年從一位原發(fā)性非典型肺炎患者的痰標(biāo)本中分離發(fā)現(xiàn)的。它是全球各年齡段呼吸道感染的常見(jiàn)病原體，可引起上呼吸道感染、氣管炎、支氣管炎、細(xì)支氣管炎、社區(qū)獲得性肺炎等，并可能與支氣管哮喘的發(fā)生和急性發(fā)作相關(guān)。MP感染一般呈自限性過(guò)程，預(yù)后良好，但近年來(lái)越來(lái)越多報(bào)道發(fā)現(xiàn)重癥與難治性MP肺炎呈

2、上升趨勢(shì)，部分患兒甚至出現(xiàn)嚴(yán)重致命并發(fā)癥。MP主要通過(guò)粘附宿主細(xì)胞、胞內(nèi)定殖、細(xì)胞毒作用及免疫反應(yīng)等方式致病，但其確切的致病機(jī)制包括肺外表現(xiàn)的發(fā)生機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究闡明。
　　我們實(shí)驗(yàn)室前期研究證明MP感染A549細(xì)胞后能誘導(dǎo)活性氧自由基(Reactiveoxygen species，ROS)形成，而ROS又進(jìn)一步誘導(dǎo)了DNA損傷。那么MP在不同細(xì)胞系是否具有同樣的DNA損傷效應(yīng)?另外，MP的粘附作用被認(rèn)為是MP致病機(jī)制中很重要

3、的因素，粘附作用與ROS的產(chǎn)生是否存在關(guān)聯(lián)?此外，前期研究還發(fā)現(xiàn)MP感染A549細(xì)胞后引起了細(xì)胞骨架蛋白波形蛋白的上調(diào)，波形蛋白與MP致病機(jī)制又有什么關(guān)系?
　　鑒于現(xiàn)有的資料，本研究擬通過(guò)以下方面進(jìn)行MP感3染相關(guān)致病機(jī)制研究：MP感染誘導(dǎo)不同細(xì)胞系造成DNA損傷的差異；MP誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生ROS與粘附作用的關(guān)系；可能影響MP感染后A549細(xì)胞中波形蛋白表達(dá)改變的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；以及波形蛋白表達(dá)對(duì)MP感染A549細(xì)胞生理應(yīng)激過(guò)

4、程的影響。
　　方法：
　　1.通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)γH2AX和堿性彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA損傷。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS水平。
　　3.免疫熒光觀(guān)察波形蛋白量的變化。
　　4.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)MAPK通路相關(guān)分子表達(dá)量的改變，熒光探針?lè)z測(cè)胞內(nèi)Ca2+水平。
　　5.siRNA干擾波形蛋白表達(dá)后研究對(duì)MP感染A549細(xì)胞的生理功能的影響。
　　結(jié)果：
　　1.A549細(xì)胞經(jīng)MP處理(10

5、CFU/cell)4h后經(jīng)免疫熒光檢測(cè)γH2AX焦點(diǎn)無(wú)增加，而MP處理12h與24h后γH2AX焦點(diǎn)形成顯著增加。HEK293細(xì)胞經(jīng)MP處理4h后有一個(gè)非常快速的增加，而隨之的12h與24h后γH2AX焦點(diǎn)并無(wú)增加。彗星實(shí)驗(yàn)提示A549細(xì)胞經(jīng)MP處理6h和12h后均存在明顯的拖尾現(xiàn)象。
　　2.去粘附能力的MP與未處理的MP均能誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生ROS，但兩者誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的能力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.免疫熒光觀(guān)察

6、到MP感染A549細(xì)胞后波形蛋白的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。
　　4.MP感染A549細(xì)胞后胞內(nèi)ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、Ca2+水平均無(wú)變化。
　　5.siRNA干擾波形蛋白后細(xì)胞的形態(tài)和生存率不受影響，但MP感染后誘導(dǎo)的γH2AX焦點(diǎn)形成減少。
　　結(jié)論：
　　1.MP可在A(yíng)549細(xì)胞和HEK293細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA損傷，但產(chǎn)生的程度和時(shí)間不同，提示不同細(xì)胞系對(duì)MP感染所誘導(dǎo)的DNA損傷的效應(yīng)存

7、在差異。
　　2.MP誘導(dǎo) A549細(xì)胞產(chǎn)生ROS與是否粘附無(wú)關(guān)。
　　3.MP感染A549細(xì)胞后誘導(dǎo)波形蛋白上調(diào)，MAPK(ERK1/2及p38)及Ca2+/CaM-CaMKⅡ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不參與MP誘導(dǎo)波形蛋白上調(diào)的過(guò)程。
　　4.波形蛋白可能影響了MP誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷的過(guò)程。
　　第二部分不同呼吸道標(biāo)本中肺炎支原體分子診斷的研究
　　背景：
　　MP常引起非特異性的呼吸道癥狀，且對(duì)β

8、-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素治療無(wú)效，所以正確及時(shí)的診斷就極為重要。MP的實(shí)驗(yàn)室診斷目前標(biāo)準(zhǔn)不一，尚缺乏敏感且特異的診斷方法。MP感染的診斷方法主要有培養(yǎng)、血清學(xué)方法以及PCR方法。其中血清學(xué)方法和PCR方法是臨床上檢測(cè)MP感染的主流手段。鼻咽吸出物(nasopharyngeal aspirate，NPA)和肺泡灌洗液(bronchaoalveolar lavage，BAL)均能作為PCR方法的標(biāo)本。有關(guān)比較使用BAL和NPA作為PCR標(biāo)本的靈敏度

9、和特異度的文獻(xiàn)很少。故本研究中我們擬評(píng)價(jià)不同的呼吸道標(biāo)本(NPA和BAL)在熒光實(shí)時(shí)定量PCR診斷兒童MP感染中的價(jià)值，并求尋找到有助于診斷MP肺炎(MPP)的臨床特征。
　　方法：
　　1.收集406例住院的肺炎患兒的NPA和BAL標(biāo)本進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MP的DNA，并采集外周血檢測(cè)MP特異性IgM。
　　2.復(fù)習(xí)和整理所有患兒的病例記錄，收集其中相關(guān)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，包括血常規(guī)、CRP、免疫球蛋白、T細(xì)胞亞群等。

10、
　　結(jié)果：
　　1.共101例患兒診斷為MPP(24.9％)。MPP患兒年齡中位數(shù)為4.1歲，非MPP患兒年齡中位數(shù)為2.4歲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)。
　　2.MPP與非MPP相比，相關(guān)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)目、免疫球蛋白(除了血清IgM)、T細(xì)胞亞群、BAL，細(xì)胞學(xué)計(jì)數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.BAL-PCR陽(yáng)性患兒BAL巨噬細(xì)胞比例低于BAL-PCR陰性患兒(p=0.003

11、)，而B(niǎo)AL中性粒細(xì)胞比例較高(p=0.007)。
　　4.采用NPA與BAL作為PCR的標(biāo)本的各項(xiàng)診斷指標(biāo)相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：NPA的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為78.6％，63.4％，39.8％和90.6％。BAL的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為70.3％，58.7％，36.0％和85.6％。
　　結(jié)論：
　　1.年齡是有助于診斷MPP的臨床特征。
　　2.BAL的PCR檢測(cè)