減毒沙門氏菌介導(dǎo)的羅非魚源無乳鏈球菌sip基因口服核酸疫苗的研究.pdf

1、羅非魚是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類。近年來，羅非魚無乳鏈球菌病的暴發(fā)給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。本課題，以2009年，在海南暴發(fā)的羅非魚無乳鏈球菌病為背景開展了針對該病的口服核酸疫苗的研究。我們將編碼Sip蛋白的sip基因克隆至真核表達(dá)載體pVAX1，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pVAX1-sip，并將該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到減毒沙門氏菌SL7207，成功構(gòu)建了以減毒沙門氏菌為載體的口服核酸疫苗。評價(jià)了疫苗的安全性、穩(wěn)定性、在羅非魚的組織分布以及口服免疫效

2、果。具體內(nèi)容包括:
　　1.羅非魚無乳鏈球菌sip基因克隆、真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在EPC細(xì)胞的表達(dá)
　　以羅非魚源無乳鏈球菌的強(qiáng)毒力株(JF423941)的DNA為模板，PCR擴(kuò)增了sip基因，并T-克隆，質(zhì)粒測序分析，sip基因長度為1002bp，編碼333個(gè)氨基酸(KJ398146.1)。在T-克隆重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，以pVAX1為載體，成功構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞，利用間接免疫

3、熒光法和蛋白免疫印跡法，證明了Sip蛋白在EPC細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和表達(dá)蛋白免疫原性。
　　2.重組減毒沙門氏菌的構(gòu)建與生物學(xué)特性鑒定
　　本章采用電轉(zhuǎn)化技術(shù)，成功將核酸疫苗質(zhì)粒導(dǎo)入了減毒沙門氏菌SL7207。對構(gòu)建的重組減毒沙門氏菌進(jìn)行了生物學(xué)特性分析，結(jié)果表明將外源基因?qū)霚p毒沙門氏菌載體菌株后，重組減毒沙門氏菌的生長特性未發(fā)生明顯變化，與原始株趨于一致。在體外，在含抗生素培養(yǎng)環(huán)境下SL7207-pVAX1和SL7207-pV

4、AX1-sip兩株重組菌的質(zhì)粒比較穩(wěn)定，傳代50代后，質(zhì)粒穩(wěn)定性仍然在90％以上;在不含抗生素培養(yǎng)環(huán)境下，重組沙門氏菌中的質(zhì)粒穩(wěn)定性有所下降，隨著傳代數(shù)的增加，可能存在質(zhì)粒的丟失，但在35代內(nèi)，穩(wěn)定性仍然能夠在80％以上，顯示了較好的穩(wěn)定性。體內(nèi)穩(wěn)定性試驗(yàn)表明減毒沙門氏菌能夠穩(wěn)定攜帶外源基因有效侵染到羅非魚的各組織器官，為核酸疫苗發(fā)揮效果提供了前提保障，同時(shí)重組菌在免疫接種后28d，能夠完全從機(jī)體消除，也表明了該重組菌具有較好的生物安全

5、性。本章還考察了烘干和儲存溫度對口服免疫飼料中重組菌的影響，結(jié)果提示低溫烘干和低溫儲存可以降低重組菌的損失率，同時(shí)建議口服免疫飼料盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，以保證最佳免疫效果。
　　3.核酸疫苗的安全性研究
　　本章將不同濃度的重組菌核酸疫苗SL7207-PVAX1-sip灌胃接種羅非魚，統(tǒng)計(jì)死亡率，得該重組菌對羅非魚的半數(shù)致死量(LD50)為1.7×1011 cfu/尾，該LD50值極高，表明對羅非魚的毒力極弱。以灌胃途徑免疫接種，在

6、不高于1.25×1010cfu/尾灌服劑量范圍內(nèi)，羅非魚不會(huì)出現(xiàn)死亡等異常癥狀，相對安全。以109cfu/mL，0.5mL/尾，灌胃接種羅非魚，整個(gè)試驗(yàn)期間羅非魚未發(fā)生死亡等異常，組織病理學(xué)觀察表明，對照組和免疫組的各個(gè)組織臟器均相對正常，該劑量下免疫接種不會(huì)對羅非魚造成病理損傷，是安全的?；蛘显囼?yàn)表明，在檢測敏感度為102拷貝數(shù)下，重組質(zhì)粒不會(huì)與羅非魚發(fā)生染色體整合。綜上，通過重組菌毒力試驗(yàn)，重組菌對羅非魚的病理損傷評價(jià)和外源基因

7、與宿主基因整合性三方面考察，均證實(shí)該疫苗對羅非魚是安全的。
　　4.核酸質(zhì)粒在羅非魚體內(nèi)的組織分布及陽性表達(dá)
　　本章對核酸質(zhì)粒和表達(dá)的Sip蛋白進(jìn)行了組織分布考察，結(jié)果表明，通過PCR檢測，證明核酸質(zhì)?？煞植加诹_非魚的腸道、肝臟、脾臟和腎臟;利用免疫組化方法，檢測到表達(dá)的蛋白可分布于脾臟和肝臟。核酸質(zhì)粒或表達(dá)的蛋白在組織內(nèi)存留的時(shí)間與免疫接種次數(shù)呈正相關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果表明，減毒沙門氏菌能夠作為核酸疫苗的運(yùn)載體，將sip基因攜帶

8、并轉(zhuǎn)移到靶組織，同時(shí)核酸疫苗質(zhì)粒能夠在羅非魚體內(nèi)進(jìn)行有效的表達(dá)，為后期免疫試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　5.重組核酸疫苗對羅非魚的免疫效果考察
　　羅非魚經(jīng)灌胃和投喂免疫飼料兩種途徑，分不同免疫次數(shù)進(jìn)行免疫接種。考察了免疫后羅非魚的血清總蛋白含量、血清總超氧化物歧化酶SOD含量、血清溶菌酶活性、血清補(bǔ)體C3含量、血清抗菌活性這些非特異性免疫指標(biāo)以及體液免疫指標(biāo)抗體效價(jià)和細(xì)胞免疫指標(biāo)IL-1β、TNF-α細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平。綜合評估了本