神經(jīng)管畸形模型的建立及RARα和Hoxd4基因表達(dá)的研究.pdf

1、目的:
　　 通過(guò)孕期一次性投入大劑量維生素A類物——全反式維甲酸，建立SD大鼠胎鼠的神經(jīng)管畸形模型，觀察E20天實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組胎鼠發(fā)生先天畸形的種類，幾率，記錄其身長(zhǎng)、體重進(jìn)行比較，并進(jìn)行病理組織切片，比較觀察其組織結(jié)構(gòu)的改變和缺損，說(shuō)明全反式維甲酸對(duì)胚胎發(fā)育的限制性和毒性作用以及其致畸性;取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組E12，E13，E14，E15，E16天胚胎的神經(jīng)管，檢測(cè)RARαmRNA及Hoxd4 mRNA的表達(dá)，了解神經(jīng)管畸形形成

2、過(guò)程中RARα及Hoxd4的異常表達(dá)，探討神經(jīng)管畸形發(fā)生的可能機(jī)制，為神經(jīng)管畸形的預(yù)防提供一定的理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.胎鼠神經(jīng)管畸形模型的建立:正常懷孕的SD大鼠隨機(jī)分為兩組:實(shí)驗(yàn)組于大鼠孕10天時(shí)，一次性給予濃度為20mg/ml，劑量為120mg/kg的atRA，所用溶劑為食用橄欖油;對(duì)照組于大鼠孕10天時(shí)給予同樣體積的橄欖油。于孕20天剖宮取胎，觀察胚胎的先天畸形情況，記錄其身長(zhǎng)、體重及數(shù)量。
　

3、　 2.病理切片:取實(shí)驗(yàn)組有明顯脊柱裂的胎鼠的腰骶部及其以下組織及對(duì)照組正常胎鼠的腰骶部及其以下組織，常規(guī)石蠟包埋、H—E染色。觀察其病理形態(tài)的變化。
　　 3.RARα及Hoxd4mRNA的檢測(cè):取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組12，13，14，15，16天胚胎的神經(jīng)管組織，利用RT-PCR測(cè)定RARαmRNA及Hoxd4mRNA的表達(dá)，了解其在胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.神經(jīng)管畸形動(dòng)物模型及其伴發(fā)畸形:

4、E20天實(shí)驗(yàn)組10只孕鼠胎鼠接受統(tǒng)計(jì)，胚胎總數(shù)109只，其中死胎5只β4.59％)，吸收胎6只(5.50％)，神經(jīng)管畸形胎鼠65只(66.33％)，類型均為脊柱裂，未發(fā)現(xiàn)腦膨出、無(wú)腦兒等其他類型的神經(jīng)管畸形，有神經(jīng)管畸形的胎鼠均伴有無(wú)尾無(wú)肛門畸形。對(duì)照組10只孕鼠，共獲得胎鼠125只，無(wú)死胎及吸收胎，胎鼠外觀均未出現(xiàn)上訴畸形。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在妊娠第20天時(shí)身長(zhǎng)及體重各數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗(yàn)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。實(shí)驗(yàn)組均較對(duì)照組

5、發(fā)育差，身長(zhǎng)、體重均低于對(duì)照組。切片形態(tài)學(xué)觀察:對(duì)照組骶、尾椎發(fā)育良好，脊髓形態(tài)正常，灰白質(zhì)分布清楚，灰質(zhì)呈蝶形分布，被覆皮膚連續(xù);實(shí)驗(yàn)組胚胎中則可見(jiàn)腰骶部脊柱裂，脊髓脊膜膨出、脊髓形態(tài)改變，灰白質(zhì)分布紊亂，灰質(zhì)蝶形區(qū)消失，多見(jiàn)炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)，被覆皮膚不連續(xù)。
　　 2.維甲酸誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)管畸形胚胎中RARαmNR及Hoxd4mNRA表達(dá)的研究:對(duì)照組RARαmRNA在E12天開(kāi)始測(cè)得表達(dá)，到E14天時(shí)處于表達(dá)高峰，E15天開(kāi)始下

6、降，E16天時(shí)降至E13天水平;實(shí)驗(yàn)組中RARαmRNA在E12天時(shí)就處于表達(dá)高峰，之后表達(dá)量逐漸下降，E12，E13，E14天表達(dá)量均高于對(duì)照組同一時(shí)段表達(dá)量(P=0.000＜0.05),E15天表達(dá)量稍低于對(duì)照組同一時(shí)段表達(dá)水平(P=0.001＜0.05)，至E16天時(shí)表達(dá)量降至對(duì)照組E16天水平(P=0.311＞0.05)。對(duì)照組Hoxd4mRNA在E12天開(kāi)始測(cè)得表達(dá)，之后表達(dá)量逐漸增高，到E15天時(shí)處于表達(dá)高峰，之后表達(dá)下降，

7、E16天時(shí)降至E13天水平;實(shí)驗(yàn)組Hoxd4mRNA在E12天就處于表達(dá)高峰，E12，E13，E14天表達(dá)量均高于對(duì)照組同一時(shí)段的表達(dá)量(P=0.000＜0.05)，到E15、E16天時(shí)，表達(dá)量稍低于對(duì)照組同一時(shí)段水平(P=0.000＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.孕期特定時(shí)間一次性投入大劑量的全反式維甲酸可限制胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育，并造成神經(jīng)管畸形在內(nèi)的多種畸形。
　　 2.RARα及Hoxd4基因的異常高表