新型Ⅰ群禽腺病毒分離株生物學(xué)特性及其致病性研究.pdf

1、Ⅰ群禽腺病毒(FAdV)分為五亞群(A-E)，具有12種血清型。FAdV-Ⅰ的五亞群包括A型(FAdV-1)，B型(FAdV-5)，C型（FAdV-4和-10），D型(FAdV-2，-3，-9和-11)和物種E(FAdV-6，-7，-8a和-8b)。在2015年之前禽腺病毒已全球傳播，F(xiàn)AdV感染主要是亞臨床癥狀或無(wú)毒性。然而，從2015年夏天起，中國(guó)許多省份出現(xiàn)了高致病性血清型病毒(FAdV-4)的爆發(fā)。這些爆發(fā)通常多發(fā)生在肉雛雞和蛋

2、雞中，與包涵體肝炎(IBH)，心包積液綜合征(HPS)，腺胃糜爛和潰瘍有關(guān)。與之前的FAdV疫情引起的輕度疾病相比，過(guò)去兩年來(lái)嚴(yán)重的FAdV感染導(dǎo)致家禽業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　在本研究中，從2015年到2016年，從臨床中分離出6株FAdV-Ⅰ。通過(guò)純化后，對(duì)這些病毒的全基因組進(jìn)行測(cè)序并進(jìn)行體外和體內(nèi)的發(fā)病機(jī)制的研究。這些初步研究是必要的，并將為診斷和開(kāi)發(fā)高效疫苗以控制疾病提供有用的依據(jù)。
　　1.雞新型腺病毒分離與生物學(xué)鑒

3、定
　　自2015年以來(lái)，安徽省和江蘇省發(fā)生多起雞包涵體肝炎-心包積液綜合征急性感染疫情，本研究采集兩省部分地區(qū)疑似包涵體肝炎癥狀雞病變肝臟病料，進(jìn)行病毒分離和鑒定。首先，將肝臟病料研磨雙抗處理后，經(jīng)卵黃囊途徑接種6～7日齡SPF雞胚，5d后雞胚死亡。發(fā)現(xiàn):胚體發(fā)育不良、瘦小、伴有大量的出血點(diǎn);雞胚肝臟出血、有的肝臟呈黃褐色，伴有斑點(diǎn)狀壞死灶。隨后，提取雞胚尿囊液的DNA，根據(jù)Ⅰ群禽腺病毒hexon基因和52k基因設(shè)計(jì)特異性引物，

4、分別PCR進(jìn)行鑒定，結(jié)果分離到6株Ⅰ群禽腺病毒，其中有5株為FAdV-ⅠC亞群血清4型，命名為HN、AQ、JS7、AH712、AH726;1株為FAdV-ⅠE亞群血清8型，命名為AH720。將分離毒株于SPF雞胚純化三次，通過(guò)對(duì)病毒理化特性和形態(tài)學(xué)特性鑒定，結(jié)果顯示以上特性均符合Ⅰ群禽腺病毒的病毒特征。
　　2.病毒全基因組序列測(cè)定及序列分析
　　為了鑒定分離株與經(jīng)典毒株的分子致病差異，本研究對(duì)5株Ⅰ群禽腺病毒血清4型分離株

5、進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定，結(jié)果可見(jiàn):HN毒株全長(zhǎng)為43724bp，AH712毒株全長(zhǎng)為43725bp，其余是43723bp，G+C含量均為54.87％。與JSJ13毒株相比，5株病毒的ORF29序列中均存在33nt的缺失。與毒株ON1毒株相比，在19531-19571nt處，分離株均存在不同程度的GAGA重復(fù)序列增加現(xiàn)象。HN、JS7、AH726、AH712、AQ與最近報(bào)道HLJ/15118高致病性腺病毒毒株相似，都位于C亞群中Group

6、Ⅱ亞分支上，而AH720位于E亞群中的另一亞分之上。
　　3.FAdV-4Taqman探針熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立
　　為了快速、準(zhǔn)確和定量檢測(cè)Ⅰ群禽腺病毒血清4型的感染，建立了一種Taqman探針熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)方法。參考GenBank中ON1毒株hexon基因（登錄號(hào):GU188428）的1293～1387nt處設(shè)計(jì)特異性引物以及Taqman特異性探針，構(gòu)建pGEM-Teasy-hexon質(zhì)粒，并以

7、其為標(biāo)準(zhǔn)品，建立了Taqman探針熒光定量PCR方法，并對(duì)其靈敏度、穩(wěn)定性和特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果成功建立的熒光定量PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為:y=-3.5237X+35.98(R2=0.998)，最低檢測(cè)限為22.8copies/μL，高于普通PCR方法2個(gè)10倍數(shù)量級(jí)。該Taqman探針熒光定量PCR方法為進(jìn)一步檢測(cè)FAdV血清4型分離株的體內(nèi)外感染和排毒水平奠定了基礎(chǔ)，也為臨床快速診斷該病感染提供了工具。

8、
　　4.分離株感染SPF雞實(shí)驗(yàn)
　　為驗(yàn)證分離株的致病性，本研究進(jìn)行動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)，設(shè)置HN、AQ、JS7、AH712、AH720和AH726攻毒組以及PBS對(duì)照組共7組，每組9只3周齡SPF雞，分別以1×105TCID50/100μL進(jìn)行肌肉注射。結(jié)果可見(jiàn)，所有病毒分離株在接種后2天內(nèi)出現(xiàn)急性禽腺病毒感染癥狀，剖檢可見(jiàn)肝臟發(fā)黃，表面出現(xiàn)出血斑，心包積液、法氏囊萎縮等明顯病變特征。采集各組死亡雞的臟器;所有組織臟器一式兩份，

9、一份保存于-80℃，一份置10％甲醛浸泡。結(jié)果顯示:HN、AQ、AH712、毒株致死率100％，AH726、JS7、AH720毒株致死率分別為83.3％、80％和30％。分別qPCR方法和H&E染色病理觀察，以HN分離株為例，攻毒2d后，攻毒組口腔和泄殖腔均能檢測(cè)到病毒;死亡雞的各組織臟器均檢測(cè)到病毒能復(fù)制增殖，其中，肝臟含量最高，其次是十二指腸、空腸和盲腸，大腦含量最低;H&E染色結(jié)果顯示:肝臟有大量典型的嗜堿性包涵體，心臟出現(xiàn)大量炎