豬流行性腹瀉病毒流行株全基因組克隆及S1蛋白單克隆抗體制備.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）疫情近來在中國和美洲等部分地區(qū)的暴發(fā)，對生豬的健康養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的影響，該病的主要癥狀表現(xiàn)為仔豬水樣腹瀉、脫水和嘔吐等，小于7日齡哺乳仔豬死亡率可達(dá)50-90％，冠狀病毒科家族成員中的甲型冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是引起PED的主要病原。
　　本研究旨在:(1)通過對不同代次非洲綠

2、猴腎(Vero)細(xì)胞適應(yīng)的PEDV臨床分離株的全基因組測序和分析，探明其遺傳穩(wěn)定性;(2)利用Bac-to-Bac系統(tǒng)，獲得PEDV流行株S1基因的真核表達(dá)蛋白;(3)制備針對PEDV流行株S1蛋白的單克隆抗體，為后續(xù)提供研究工具。
　　1.PEDV臨床分離株的全基因組測序和分析
　　PEDV臨床分離株(ZJ15XS0101株)全基因組大小為28067bp，依次順序?yàn)?'UTR(292bp)、ORF1ab(20345bp)、

3、S(4161bp)、ORF3(675bp)、E(231bp)、M(681bp)、N(1326bp)和3'UTR(363bp)。第16代次和第35代次病毒與第1代次進(jìn)行基因組全序列比較，核苷酸和氨基酸序列的相似性達(dá)到99.99％。在主要保護(hù)性抗原基因S基因上，第16代次和第35代次病毒序列的同源性為100％。
　　2.基于Bac-to-Bac的PEDV流行株全長S1蛋白表達(dá)純化
　　通過對PEDV流行株S1基因密碼子的優(yōu)化，構(gòu)

4、建了攜帶蜂素信號肽和S1基因的重組質(zhì)粒pFast-His-S1以及重組桿粒Bacmid-His-S1，重組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞后獲得了重組桿狀病毒。利用第三代重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了重組His-S1蛋白的表達(dá)，經(jīng)鎳柱純化和SDS-PAGE分析顯示，重組His-S1蛋白為分泌表達(dá)，大小約為110kDa，細(xì)胞上清中的表達(dá)量約4μg/mL;重組蛋白經(jīng)蛋白質(zhì)測序、間接免疫熒光（Indirect immunofluorescence

5、assay，IFA）和免疫印跡(Western Blot)分析，PEDV流行株S1蛋白表達(dá)正確，重組蛋白可與兔抗PEDV CV777株多抗和豬抗ZJ15XS0101株多抗反應(yīng)。
　　3.PEDV流行株S1蛋白的單克隆抗體制備
　　利用純化的真核表達(dá)His-S1蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)克隆化篩選，獲得了2株（6B4和6G1）穩(wěn)定分泌S1蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)Western Blot和IFA