豬流行性乙型腦炎單克隆抗體的制備及對病毒蛋白EDⅢ表位的鑒定.pdf

1、豬流行性乙型腦炎（Japanese encephalitis，JE），簡稱乙腦，是由豬流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的常見病毒性腦炎，對人的致死率高，約為25～40％，對豬的致死率不高，但引起造成懷孕母豬發(fā)生繁殖障礙是主要的經(jīng)濟(jì)損失，對作為畜牧業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)的養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)增產(chǎn)造成巨大的危害。近年來，乙腦的傳染范圍不斷擴(kuò)大，嚴(yán)重威脅公共安全和養(yǎng)殖業(yè)。而抗乙腦病毒的中和性單抗能夠有效地降低

2、病毒的致病能力，且具有較高的特異性和生物學(xué)活性，在病毒的診斷檢測和治療預(yù)防中有著良好的應(yīng)用前景。
　　 本文用常規(guī)的雜交瘤制備技術(shù)獲得了抗乙腦病毒（N J2008株，GQ918133，以下實驗中所用的乙腦病毒均為此株）的7株單抗，用BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)后凍于-20℃，反復(fù)凍融三次后經(jīng)蔗糖密度梯度離心，將所獲純化病毒免疫BALB/c小鼠，4次免疫后取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，用ELISA法進(jìn)行篩選，抗原即為免疫原，加強(qiáng)免疫時

3、用EDⅢ，篩選時分別用EDⅢ和純化的乙腦病毒篩選。最后獲得七株能穩(wěn)定分泌的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1H5F9、2D7E4、2B4B4、1H4、2E3、2B4、4D4，然后用常規(guī)方法免疫小鼠制備腹水，并測亞型后用ProteinA純化柱純化。
　　 用ELISA、Western Blot、IFA、流式細(xì)胞術(shù)以及中和實驗等方法鑒定7株單抗的生物學(xué)特性。結(jié)果顯示1H5F9、2D7E4、2B4B4能識別BHK-21細(xì)胞的蛋白，1H4和2B4

4、只識別EDⅢ而2E3和4D4兩種都能識別，因此1H5F9、2D7E4、2B4B4由于只識別細(xì)胞而淘汰，2E3和4D4則在后續(xù)的實驗作為對照。中和試驗結(jié)果顯示4株單抗都有一定的中和活性，且結(jié)果為:2B4＞1H4～4D4＞2E3。臨床實例應(yīng)用進(jìn)一步證明用特異性和反應(yīng)性最高的2B4能夠檢測出感染JEV的小鼠的腦脊液中JEV的存在及水平。
　　 根據(jù)單抗特性鑒定的結(jié)果，1H4和2B4能與JEV的EDⅢ和MEP都反應(yīng)，且WesternBl

5、ot顯示表位是在同一個蛋白上，因此推斷這2株單抗的識別位點是在EDⅢ和MEP共有序列上的。同時，本文用M13噬菌體展示肽庫篩選單抗的表位，以進(jìn)一步驗證上述推斷。MegAlign和Blast的結(jié)果顯示，“HH-H”(E394-E397)是最有可能的結(jié)合位點。在此基礎(chǔ)上，合成EDⅢ和MEP共有序列多肽，P1:TVN PFV A(E356-E362)和P2: EME PPF GDS YIV VGR GDK QIN HHW HKA(E373-E

6、399)以及含噬菌體篩選出的位點的短肽NHH WHKA(E394-E398)，用ELISA進(jìn)一步驗證，發(fā)現(xiàn)1H4與3條肽都反應(yīng)，而2B4則只與P3反應(yīng)，并且用P3作為抗原能夠檢測豬的乙腦陽性血清，說明E394HHWHE398能有效誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，且E396-M很可能是決定中和活性的一個關(guān)鍵位點。空間構(gòu)象和理化分析顯示該位點在β折疊的末端，且E394HHWHE398富含親水氨基酸，能夠作為表位誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)。因此，該位點對乙腦的進(jìn)一步研究