豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原,并可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制,嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展。PCV2包含兩個(gè)主要的開放性閱讀框ORF1和ORF2,分別編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep)和病毒衣殼蛋白(Cap)。Cap蛋白為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,在抗病毒感染免疫中起到重要的保

2、護(hù)作用,并具有多個(gè)抗原表位。本研究以重組桿狀病毒表達(dá)的重組Cap蛋白為免疫原,通過小鼠雜交瘤技術(shù),成功制備6株抗PCV2 Cap的單克隆抗體,并對(duì)其識(shí)別的抗原表位進(jìn)行了初步分析,研究?jī)?nèi)容包括:
　　 1.利用重組桿狀病毒表達(dá)的PCV2 Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,經(jīng)3次免疫后取脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合,通過3次亞克隆,用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性克隆,獲得6株能穩(wěn)定分泌抗PCV2 Cap蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分

3、別命名為3H9/1H5、3H9/3C7、4A9/3E2、4A9/3D7、6G7/786和6G7/8D3。
　　 2.采用間接ELISA方法測(cè)得該6株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的效價(jià)分別為1:1024,1:1024,1:2048,1:2048,1:1024和1:1024；誘導(dǎo)同品系小鼠產(chǎn)生的腹水效價(jià)分別為1:204800,1:204800,1:1310720,1:1310720,1:163840和1:163840。體外連續(xù)培養(yǎng)60d,傳代

4、20次,分別取第5、10、20代的培養(yǎng)上清,檢測(cè)其抗體效價(jià),結(jié)果基本一致。亞類鑒定結(jié)果顯示,3H9/1H5、3H9/3C7、6G7/786和6G7/8D3為IgG1型,4A9/3E2和4A9/3D7為IgG2b型,所有單抗的輕鏈均為κ型。Western blot分析結(jié)果表明,6株單抗均能與重組Cap蛋白和純化PCV2粒子發(fā)生特異性反應(yīng)。IFA鑒定結(jié)果表明,6株單抗均可與PCV2毒株產(chǎn)生特異性反應(yīng),能夠識(shí)別病毒天然結(jié)構(gòu)蛋白。
　　

5、 3.通過對(duì)6株單抗的識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行初步分析,發(fā)現(xiàn)它們針對(duì)3個(gè)不同的抗原表位,其中3H9/1H5與3H9/3C7、4A9/3E2與4A9/3D7、6G7/786與6G7/8D3的識(shí)別位點(diǎn)相似。以原核表達(dá)的5種截?cái)嘀亟MPCV2 Cap蛋白(CapA:51-150aa,CapB:51-200aa,CapC:51-233aa,CapD:101-200aa,CapE:101-233aa)為抗原,通過Western blot分析進(jìn)一步鑒定這些單抗的