索拉非尼聯(lián)合三氧化二砷對(duì)肝癌細(xì)胞株增殖及凋亡的影響.pdf

1、原發(fā)性肝癌(primaryhepaticcarcinoma，PHC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。我國(guó)是世界上肝癌的高發(fā)地區(qū)，肝癌死亡率居全國(guó)各種腫瘤的第2位，并且近10年來(lái)死亡率一直呈上升趨勢(shì)。盡管近年來(lái)肝癌研究已取得了很大的進(jìn)步，療效也得到明顯改觀(guān)，但就肝癌整體療效而言仍很不理想。目前，肝細(xì)胞癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、肝動(dòng)脈栓塞化療(TACE)、冷凍治療、射頻消融、體外放療、放射性粒子植入、生物治療等.由于肝癌起病隱襲，多數(shù)患者就診時(shí)腫

2、瘤已進(jìn)展至晚期，能行手術(shù)切除的肝癌尚不足25％。肝動(dòng)脈栓塞化療被證明有效，但并非所有病人都適合。全身化療對(duì)晚期肝癌作用有限，單藥化療或聯(lián)合化療，其有效率均不足20％。故尋找一種合理有效的治療晚期PHC方案具有重要意義。 索拉非尼(Sorafenib，nexavar)是一種雙芳基尿素類(lèi)口服多激酶抑制劑，其抗腫瘤機(jī)制包括兩個(gè)方面。一方面可靶向作用于腫瘤細(xì)胞及腫瘤血管上的絲氨酸/蘇氨酸激酶及受體酪氨酸激酶，通過(guò)抑制受體酪氨酸激酶KIT

3、和FLT-3，以及Raf/MEK/ERK途徑中絲氨酸/蘇氨酸激酶，抑制腫瘤細(xì)胞增殖；另一方面，通過(guò)上游抑制受體酪氨酸激酶VEGFR和PDGFR，及下游抑制Raf/MEK/ERK途徑中絲氨酸/蘇氨酸激酶，抑制腫瘤血管生成。ScottM.Wilhelm等發(fā)現(xiàn)Sorafenib能通過(guò)抑制Raf-1及其相關(guān)的激酶、野生型或V599E突變型B—RAF的活性來(lái)阻斷Raf/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，還能顯著抑制一些酪氨酸激酶受體的活性，包括干細(xì)胞因

4、子受體(KIT)、Fms樣酪氨酸激酶(FLT-3)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(VEGFR-2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-3(VEGFR-3)、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體-β(PDGFR-β)等。LiLiu等證實(shí)Sorafenib能下調(diào)肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/PRF/5與HepG2的MEK、ERK蛋白磷酸化水平和cyclinD1水平，并且能下調(diào)eIE4E與抗凋亡蛋白Mcl-1水平，通過(guò)抑制MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑與MEK/ERK非依賴(lài)信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)

5、抑制肝癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。索拉非尼治療肝癌的Ⅲ期雙盲隨機(jī)對(duì)照臨床(SHARP)研究顯示：與安慰劑相比，索拉非尼顯著延長(zhǎng)晚期HCC患者的總體生存達(dá)44％。索拉非尼組與安慰劑組中位OS分別為10.7個(gè)月及7.9個(gè)月，兩組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與安慰劑組相比，索拉非尼組的中位TTP更長(zhǎng)(5.5個(gè)月對(duì)2.8個(gè)月)，疾病控制率(DCR)更高(43％對(duì)32％)。已有臨床試驗(yàn)表明，Sorafenib與化療藥如氮烯咪胺、紫杉醇、卡鉑以及其他靶向

6、藥物如吉非替尼、貝伐單抗聯(lián)用，能提高化療藥及其他靶向藥物的抗腫瘤療效。索拉非尼被確立成為第一個(gè)批準(zhǔn)治療晚期HCC的靶向治療藥物。三氧化二砷(Arsenictrioxide，As2O3)為中藥砒霜、復(fù)方青黛的主要成分，我國(guó)學(xué)者將其用于白血病的治療，取得了顯著的成就。已有多項(xiàng)體內(nèi)、體外研究發(fā)現(xiàn)As2O3對(duì)肝癌細(xì)胞有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。 Sorafenib和As2O3在治療肝細(xì)胞癌中抑制增殖、促進(jìn)凋亡的機(jī)制不同，兩藥聯(lián)合可多靶點(diǎn)，

7、多途徑治療肝細(xì)胞癌。本研究主要從體外實(shí)驗(yàn)研究Sorafenib和As2O3聯(lián)合對(duì)肝細(xì)胞癌的抑制作用，分析兩藥聯(lián)合的性質(zhì)，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究共分兩個(gè)部分： 第一部分：索拉非尼聯(lián)合三氧化二砷對(duì)肝癌細(xì)胞株增殖抑制作用的研究 目的：觀(guān)察Sorafenib、As2O3單藥和聯(lián)用對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞株的增殖的抑制，比較兩藥聯(lián)合作用與單藥作用的差異以及分析兩藥的交互效應(yīng)。 研究方法及內(nèi)容：

8、 1.細(xì)胞培養(yǎng)：HepG2細(xì)胞在37℃、5％的CO2孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清、1％的雙抗(青霉素和鏈霉素)的RPMI1640。細(xì)胞為上皮樣細(xì)胞，每2～3d傳代1次，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 2.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞種板，培養(yǎng)24h后加入藥物。實(shí)驗(yàn)分組：Sorafenib6、3、1.5μmlo/L和AsO34、2μmol/L分別組成單藥組和Sorafenib+As2O3聯(lián)合用藥組，另設(shè)不加藥的對(duì)照組，加藥后

9、分別培養(yǎng)24、48、72h后，終止培養(yǎng)，加入MTT液，用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)570nm)測(cè)定各孔的OD值。根據(jù)下列公式計(jì)算對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率：抑制率=(1—實(shí)驗(yàn)藥物組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100％ 3.統(tǒng)計(jì)方法：所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)圭標(biāo)準(zhǔn)差(茗士葶)表示。兩樣本均數(shù)的比較采用Independent—SamplesTTest，多組間均數(shù)比較采用One—wayANOVA，posthoc

10、test方差齊性采用LSD法，方差不齊的采用DunnettT3法。交互效應(yīng)分析采用factorialanalysis。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：兩藥單用及聯(lián)用對(duì)HepG2細(xì)胞均有抑制增殖的作用，兩藥聯(lián)用較之單藥的抑制作用更強(qiáng)，兩藥聯(lián)用的性質(zhì)為協(xié)同。 第二部分：索拉非尼聯(lián)合三氧化二砷對(duì)肝癌細(xì)胞株的凋亡誘導(dǎo)作用及機(jī)制研究 目的：觀(guān)察Sorafenib、As2O3單藥和聯(lián)用對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的凋亡的誘導(dǎo)作用，

11、探討兩藥單用與聯(lián)用誘導(dǎo)凋亡的可能機(jī)制。 研究方法及內(nèi)容： 1.實(shí)驗(yàn)分組：Sorafenib4μmol/L，As2O33μmol/L，聯(lián)合組Sorafenib4μmol/L+As2O33μmol/L，另設(shè)不加藥的對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)：HepG2細(xì)胞在37℃、5％的CO2孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清、1％的雙抗(青霉素和鏈霉素)的RPMI1640。細(xì)胞為上皮樣細(xì)胞，每2～3d傳代1次，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

12、 2.AnnexinV—FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞株HepG2，用0.25％胰蛋白酶消化，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液制備成濃度為2×105/ml的細(xì)胞懸液，接種2.5ml/孔于6孔培養(yǎng)板中，使其細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)/孔。培養(yǎng)24h后取出培養(yǎng)板，對(duì)照組加入RPMI-1640培養(yǎng)液0.5ml；索拉非尼組添加稀釋的Sorafenib藥液0.5ml至終濃度3μmol/L；三氧化二砷組加入稀釋的

13、As2O3藥液0.5ml至終濃度4μmol/L；聯(lián)合用藥組加入稀釋的As2O3藥液0.25ml至終濃度4μmol/L，稀釋的索拉非尼藥液0.25ml至終濃度為3μmol/L。置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h。取出培養(yǎng)板，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞離心2000rpm×5min，棄去上清液。PBS洗滌。加入500μL的BindingBuffer懸浮細(xì)胞，加入5μLAnnexinV—FITC混勻后，加入5μLPropidiumIodid

14、e，混勻。室溫避光反應(yīng)5～15min。1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 3.羅丹明123染色檢測(cè)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位變化。細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理同前述。加藥后48h收集細(xì)胞。加入羅丹明123染液10μg/mL。37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育10min，離心以培養(yǎng)基洗細(xì)胞兩次。重懸細(xì)胞于培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2培養(yǎng)60min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)。計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度，相對(duì)熒光強(qiáng)度=加藥組熒光強(qiáng)度/對(duì)照組熒光強(qiáng)度。 4.比色法檢測(cè)casp

15、ase-3的活化程度。細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理基本同前述。加藥后48h收集細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞2次。在收集的沉淀細(xì)胞中加入50μL冰冷LysisBuffer，吹打均勻。置冰上裂解30min，其間渦旋振蕩3～4次，每次10s。4℃，離心(10，000rpm)1min。小心吸取上清轉(zhuǎn)移至新的管中，并放置冰上待用。取1μL上清，常規(guī)方法BCA法測(cè)定其中的蛋白濃度。吸取50μL含200μg蛋白的細(xì)胞裂解上清。加入50μL的2×ReactionBuf

16、fer，使用前每50μL2×ReactionBuffer加入0.5μLDTT。加入5μLCaspase-3Substrate并于37℃避光孵育4h。用酶標(biāo)儀在λ=405nm測(cè)定其吸光值。通過(guò)計(jì)算OD處理組/OD對(duì)照組的倍數(shù)來(lái)確定處理組Caspase-3活化程度。 5.統(tǒng)計(jì)方法：所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(—x±s)表示，均數(shù)比較采用one—wayANOVA。posthoetest方差