小鼠孤雌胚胎干細(xì)胞直接向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實驗研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(embryonicst emc ell,ES)是一種從哺乳動物囊胚中獲得的全能細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞能在體外特定條件下無限地自我更新并能分化成體內(nèi)任何一種細(xì)胞，因此它在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域和臨床治療領(lǐng)域都有重要的研究價值。神經(jīng)退行性疾病(如帕金森，老年性癡呆等)和神經(jīng)系統(tǒng)損傷(如中風(fēng)，腦缺血，脊髓損傷等)是多發(fā)性疾病?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞(neural Stem Cells，NSCs)移植可以替代死亡或退變的神經(jīng)元，移植后可明顯改善上述疾

2、病的臨床癥狀，這一成果對神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)和退行性疾病的治療具有劃時代的意義。因此，ES細(xì)胞向神經(jīng)方向誘導(dǎo)分化目前成為科學(xué)研究的熱點。胚胎干細(xì)胞有四種來源：一是從正常受精卵形成的囊胚中獲得；二是從早期胚胎生殖嵴中獲得；三是從核轉(zhuǎn)移途徑得到的囊胚中獲得；四是從孤雌生殖形成的囊胚中獲得。第四種途徑產(chǎn)生的胚胎干細(xì)胞稱為孤雌胚胎干細(xì)胞。孤雌胚胎干細(xì)胞作為一種特殊的胚胎干細(xì)胞有著重要的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用價值，普通胚胎干細(xì)胞系由于主要組織相容復(fù)合物(MH

3、C)在不同個體之間存在顯著差異將可能導(dǎo)致移植后免疫排斥，而孤雌胚胎干細(xì)胞的MHC等位基因是純合子，因此從理論上將大大降低免疫排斥的可能性。近來己有文獻(xiàn)報道哺乳動物孤雌胚胎干細(xì)胞具有向三個胚層細(xì)胞分化的能力，因此孤雌胚胎干細(xì)胞將來也可以作為細(xì)胞治療的一個來源。 目的：探討小鼠孤雌胚胎干細(xì)胞在體外不經(jīng)過擬胚體(embryoid body,EB)階段，直接誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的可行性。 材料與方法：昆明小鼠品系孤雌胚胎干細(xì)胞株m

4、PGES為山東大學(xué)省立醫(yī)院干細(xì)胞研究中心自建。該細(xì)胞株經(jīng)微衛(wèi)星技術(shù)檢測表明為孤雌來源，堿性磷酸酶呈陽性表達(dá)，表面標(biāo)志物Oct-4(octamer-binding transcription factor-4)、階段特異性胚胎抗原(stage-specific embryonic antigen，SSEA)-1呈陽性，SSEA-4陰性。表現(xiàn)正常二倍體核型，將mPGES接種于重度聯(lián)合免疫缺陷(severecombined immune de

5、ficiency,SCID)小鼠皮下8周后，出現(xiàn)腫塊，病理切片觀察可見三個胚層的組織，以上資料表明該細(xì)胞株具有胚胎干細(xì)胞特性。實驗采用階段誘導(dǎo)的方法，首先由孤雌胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞定向分化，通過巢蛋白(nestin)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色對神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)行鑒定。在此基礎(chǔ)上，從培養(yǎng)基中撤除bFGF和EGF，加入5％胎牛血清，觀察已分化的神經(jīng)前體細(xì)胞能否進(jìn)一步分化為神經(jīng)細(xì)胞，并對分化出的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)鑒定。 結(jié)果：經(jīng)選擇

6、培養(yǎng)基培養(yǎng)3d后的孤雌胚胎干細(xì)胞絕大多數(shù)可誘導(dǎo)為神經(jīng)前體細(xì)胞，細(xì)胞呈小圓形，棗核狀，多有兩個突起，在形態(tài)學(xué)上具有神經(jīng)前體細(xì)胞特征。經(jīng)nestin鑒定，絕大部分細(xì)胞呈nestin陽性。加入血清進(jìn)一步誘導(dǎo)分化，大約培養(yǎng)lO天后，可觀察到有神經(jīng)上皮樣細(xì)胞存活。經(jīng)GFAP，β-Ⅲ-tubline鑒定，為β-Ⅲ-tubline陽性，說明存活細(xì)胞為早期神經(jīng)元細(xì)胞。 結(jié)論：(1)本實驗室所建的小鼠孤雌胚胎干細(xì)胞mPGES經(jīng)過體外誘導(dǎo)方成功誘導(dǎo)