Wnt-β-catenin信號途徑及ILK在糖尿病性腎小管間質纖維化發(fā)病中作用的研究.pdf

1、目的：糖尿病腎病（DN）是糖尿病常見并發(fā)癥，是引起終末期腎衰的主要原因之一，其主要病理變化為腎小球肥大，腎小球和腎小管基底膜增厚、細胞外基質聚集、腎小球硬化、腎小管萎縮及間質纖維化等。以往對DN的研究大多集中在腎小球病變，而對腎小管間質病變的發(fā)生發(fā)展及其機制研究較少。近來越來越多的研究表明糖尿病腎小管間質病變的嚴重程度與腎功能的進行性下降密切相關。高糖可誘導腎小管上皮細胞表型向間充質細胞轉變，分泌并聚集細胞外基質而導致腎間質纖維化發(fā)生。

2、糖尿病腎病小管間質病變是決定其腎功能下降水平及預后的重要因素。
　　 Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號途徑參與細胞增殖、分化、存活、凋亡及細胞遷移等多種功能的調控，在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生和器官纖維化等重要生理及病理過程中發(fā)揮重要作用。已有研究表明Wnt/β-catenin信號途徑調節(jié)高糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡過程，在單側輸尿管梗阻（UUO）腎臟該途徑表達上調，提示此途徑可能參與了慢性腎臟病的發(fā)病。
　　 整

3、合素連接激酶（ILK）被認為是轉化生長因子β1（TGFβ1）下游最重要的致纖維化因子之一。在慢性腎臟病、糖尿病腎病及UUO模型梗阻側腎臟均發(fā)現(xiàn)ILK過度表達加重細胞外基質的積聚及腎臟纖維化的程度。ILK過度表達可激活Wnt信號通路下游分子，也就是說通過抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）活性促使β-catenin核聚集。ILK可能通過與Wnt信號途徑“串話（cross talk）”而參與了腎小管間質纖維化的發(fā)病。
　　 在糖

4、尿病腎臟病變中Wnt/β-catenin信號轉導途徑的作用及該途徑與ILK的關系尚有許多未知。本研究應用糖尿病大鼠模型和體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細胞（HKC），系統(tǒng)觀察了Wnt/β-catenin信號途徑及ILK在早期糖尿病腎病以及高糖誘導HKC轉分化中的表達；用ILK小干擾RNA（ILKsiRNA）沉默ILK基因表達，觀察了Wnt/β-catenin途徑下游因子在高糖誘導HKC轉分化過程中的變化；并結合糖尿病腎病患者腎臟Wnt/β-

5、catenin信號途徑表達的變化，以進一步探討Wnt途徑在糖尿病腎病腎小管間質纖維化中的作用。以期為進一步闡明糖尿病腎小管間質纖維化發(fā)病機制及尋找新的治療靶點提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.大鼠糖尿病模型的制備和ILK、Wnt4、GSK-3β、β-catenin蛋白及mRNA的檢測
　　 Wistar雄性大鼠均行右腎切除術，傷口愈合后隨機分為對照組（CG）和糖尿病組（DM），DM組大鼠腹腔單次注射鏈脲佐菌素6

6、5mg/kg（STZ溶于0.1mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，pH值4.5），對照組只注射相同體積的枸櫞酸鹽緩沖液，48h后測定血糖和尿糖，血糖值≥16.7mmol/L，尿糖值+++～++++者確定為DM模型。成模后4、8、12周每組取6只大鼠，切取腎臟。取部分腎皮質組織置于4％多聚甲醛固定，用光鏡及免疫組織化學染色法檢測，免疫組化檢測指標包括ILK、Wnt4、β-catenin、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達；取部分腎皮質組織提取總

7、蛋白及核蛋白，Western blot檢測ILK、Wnt4、β-catenin、GSK-3β、磷酸化GSK-3β蛋白（P-GSK-3β）表達；取部分腎皮質組織提取總RNA，半定量RT-PCR檢測Wnt4、β-catenin mRNA表達。
　　 2.細胞培養(yǎng)和ILK、Wnt4、GSK-3β、β-catenin蛋白及mRNA的檢測體外培養(yǎng)HKC，無血清DMEM培養(yǎng)基同步培養(yǎng)24h，細胞分成3組：正常糖組（NG，D-Glucose5

8、.5mmol/L），甘露醇對照組（NG+M，D-Glucose5.5 mmol/L+mannitol24.5 mmol/L），高糖組（HG，D-Glucose30 mmol/L），培養(yǎng)12、24、48、72h后收集細胞提取細胞總蛋白、核蛋白及RNA。采用免疫細胞化學檢測Wnt4、β-catenin及E-鈣粘蛋白（E-cadherin），α-SMA的表達；Western blot檢測ILK、Wnt4、GSK-3β、P-GSK-3β、β-c

9、atenin蛋白的表達；半定量RT-PCR檢測細胞Wnt4、GSK-3β及β-catenin mRNA的水平。
　　 3.HKC ILKsiRNA轉染及ILK、GSK-3β、β-catenin表達的檢測
　　 針對HKC ILK編碼序列分別設計3條體外轉錄的shRNA。應用lipofectamine2000轉染試劑將Pgenesil-1.1-ILKsiRNA真核表達載體轉染入HKC，分成6組：①正常對照組（NG）；②高糖

10、組（HG）；③高糖+陰性轉染對照組：轉染pGenesil-1.1-HK（HG+HK）；④高糖+pGenesil-1.1-ILK-1（HG+ILK-1siRNA）組；⑤高糖+pGenesil-1.1-ILK-2（HG+ILK-2siRNA）組；⑥高糖+pGenesil-1.1-ILK-3（HG+ILK-3siRNA）組。轉染48h熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達。Western-blot及RT-PCR檢測ILK蛋白及RNA

11、表達水平，確定敲低效果最佳的ILK siRNA。免疫細胞化學法檢測P-GSK-3β、β-catenin表達。Western blot檢測GSK-3β、P-GSK-3β、β-catenin、E-cadherin和α-SMA表達。
　　 4.病例選擇及腎組織Wnt4、P-GSK-3β、β-catenin的表達的檢測
　　 選擇2006.10-2008.10在河北醫(yī)大二院腎內科住院、經(jīng)臨床與腎活檢診斷為糖尿病腎病患者33例（其

12、中男性18例，女性15例，年齡28-70歲，48.7±10.3歲）。除外狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎、乙肝病毒相關性腎炎、甲狀腺病相關性腎損害、類風濕性關節(jié)炎腎損害以及腫瘤相關性腎病等繼發(fā)性腎臟病患者，并除外合并急性。腎小管壞死和急、慢性間質性腎炎的患者。糖尿病腎病患者根據(jù)腎小管間質病變程度分為兩組，輕中度組20例，重度組13例。10例腎腫瘤患者遠離腫瘤的正常腎組織作為對照。詳細收集患者臨床資料，包括年齡、病程、血漿白蛋白、24小時尿蛋白定量

13、、血肌酐等。免疫組化法檢測Wnt4、P-GSK-3β、β-catenin蛋白的表達。
　　 結論：
　　 1.Wnt/β-catenin信號途徑在糖尿病腎病早期以及高糖誘導腎小管上皮細胞轉分化過程中表達增高，該途徑可能參與了糖尿病腎病腎小管間質纖維化的發(fā)生和進展。
　　 2.ILK在糖尿病腎病早期腎小管間質病變及高糖誘導的腎小管上皮細胞轉分化過程中表達增高；轉染HKC ILKsiRNA能成功沉默ILK基因，使P-