銀杏葉提取物對沙土鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用.pdf

1、臨床上各種原因造成的組織血液灌流量減少可引起缺血性損傷。但在臨床和實驗中發(fā)現(xiàn)，缺血時間較長，盡管未造成組織不可逆損傷，但在恢復血液灌注時，組織反而出現(xiàn)比再灌注前更明顯、更顯著的損傷和功能障礙，這種現(xiàn)象被稱為缺血一再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)。現(xiàn)已證明，不同種屬和各種組織器官都可發(fā)生再灌注損傷。探索缺血一再灌注損傷的特點、規(guī)律和發(fā)生機制，已成為當今醫(yī)學的研究熱點．腦是一個對缺血缺氧極敏感的器

2、官，短暫腦缺血即可導致一系列的功能和代謝紊亂。再灌注損傷可以使復流腦組織神經細胞壞死或凋亡加重，水腫明顯，梗死面積擴大，并繼發(fā)血管內皮組織細胞損傷及植物神經功能障礙。腦缺血再灌注損傷的病理生理是一個多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的酶促級聯(lián)反應，作用機制十分復雜，這就要求藥物在疾病進程中多途徑起作用，或者在疾病發(fā)展過程中應用不同的藥物，以阻止腦缺血后級聯(lián)反應所帶來的繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生。 隨著基礎、臨床研究的不斷深入，人們對缺血再灌注的

3、認識也不斷加深，但是具體的病理生理機制尚未完全闡明。一方面，腦缺血再灌注可以挽救瀕臨梗死的細胞，另一方面則加重細胞損傷，導致細胞死亡。以往對腦缺血再灌注損傷機制的研究主要集中在氧自由基，興奮性氨基酸，細胞內鈣超載等方面，近年來隨著分子生物學的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)其與炎癥反應和細胞凋亡也有著密切的關系，而且各機制之間還存在著網絡聯(lián)系。 銀杏葉提取物(Ginkgo biloba Extracts，EGb761)是從銀杏(Ginkgo bilo

4、ba L．)的葉中利用醇溶液提取出的物質，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)其具有抗缺血缺氧，增加腦血流量，捕獲自由基，抗血小板活化因子誘導的血小板聚集等作用。但目前對細胞凋亡及凋亡相關基因的調控作用卻報道不多。 本實驗利用蒙古沙土鼠(Mongolian gerbil)雙側頸總動脈夾閉造成短暫性腦缺血再灌注損傷模型，觀察腦缺血再灌注后超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)的變化及腦組織神經細胞凋亡情況，以及EGb761對

5、其的影響，以明確EGb761對腦缺血再灌注損傷可能的保護機制，為深入探討腦缺血再灌注損傷的發(fā)生機制和EGb761的腦保護作用機制提供一些有價值的研究資料。 研究目的： 通過觀察沙土鼠腦缺血再灌注后組織勻漿中超氧化物歧化酶及過氧化氫酶活性、丙二醛含量的變化和神經細胞凋亡率，探討銀杏葉提取物對沙土鼠腦缺血再灌注損傷保護作用的可能機制。 實驗材料與方法： 1.實驗動物及分組。 1.1來源健康成年蒙古沙土

6、鼠，體重60-70克，雌雄兼用，由浙江省醫(yī)學科學院提供。 1.2分組按照實驗設計將88只沙土鼠隨機分為3組．假手術組8只、缺血再灌組及EGb761組各40只。根據(jù)缺血再灌注時間，將缺血再灌組及EGb761組再隨機分為5個亞組，分別對應5個不同的再灌注時間(3、6、12、24、72小時)，每亞組各8只沙土鼠。其中每組的半數(shù)用于腦組織勻漿液的SOD、CAT及MDA檢測，另半數(shù)用于凋亡染色。 2.實驗器械、設備及藥品試劑。

7、 2.1實驗器械、設備： (1)普通手術器械一套、手術操作臺、烤燈。 (2)光學顯微鏡(OLYMPUS)、圖像分析儀(Panasonic)、數(shù)碼相機(OLYMPUS)。 (3)FSH-Ⅱ型高速電動勻漿器。 (4)低速離心機。 (5)紫外分光光度計。 (6)數(shù)顯恒溫水浴鍋。 (7)石蠟切片機。 (8)石蠟包埋機。 2.2藥品、試劑： (1)10％水合氯醛、

8、生理鹽水注射液、肝素鈉注射液。 (2)4％多聚甲醛。 (3)載玻片、蓋玻片、梯度酒精，二甲苯、蘇木素、中性樹膠等。 (4)銀杏達莫注射液。 (5)SOD、CAT及MDA測定試劑盒。 (6)TUNEL試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺試劑盒。 (7)其余試劑均為國產分析純。 3.實驗方法。 3.1模型制備方法實驗動物采用Kirino等沙土鼠雙側頸總動脈阻斷模型． 3.2給藥方法對E

9、Gb761組分別于缺血前30min及缺血后即刻給予銀杏達莫注射液100mg/kg腹腔內注射．假手術組和缺血再灌組給予等體積生理鹽水。 3.3嚴格按試劑盒操作步驟測定腦組織勻漿中SOD、CAT及MDA的含量。 3.4末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(terminaldeoxynucleotidyl transferase-meditated dUTP-nick end labeling，TUNEL)法檢測凋亡

10、細胞。 實驗結果： 實驗過程中，有3只沙土鼠考慮因麻醉意外死亡，補充3只造模成功沙土鼠，最后進入結果分析的沙土鼠保持為88只。 1.腦組織勻漿液中SOD、CAT及MDA的變化：與假手術組相比，缺血再灌注后，腦組織勻漿液SOD及CAT活性明顯下降(P<0.05)，MDA濃度顯著升高(P<0.05)。銀杏葉提取物(100mg/kg)使用后腦組織中SOD及CAT含量增加，MDA的含量減少，與模型組比較存在顯著差異(P<

11、0.05)。動態(tài)觀察可見：SOD、CAT及MDA的變化從再灌注早期即出現(xiàn)，隨著缺血再灌注時間的延長，這種改變更明顯，于再灌24小時時腦SOD及CAT減少最為明顯，MDA增加也達到高峰，此后出現(xiàn)回落。 2.凋亡染色檢測結果：假手術組腦片中CA1區(qū)未出現(xiàn)神經元凋亡，腦缺血再灌注早期即3小時即有凋亡細胞的表達。凋亡細胞陽性率隨著再灌注時間的延長進行性增高，直至72小時未見有下降趨勢，凋亡細胞主要分布在CA1區(qū)，細胞變形，濃染，胞核染成