Skp1蛋白在小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的功能研究.pdf

1、為了篩選一些在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中起作用的蛋白，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了小鼠卵細(xì)胞激活前后的蛋白譜系，通過(guò)質(zhì)譜鑒定、生物信息學(xué)分析及相關(guān)文獻(xiàn)查閱，我們選擇了Skpl這個(gè)蛋白進(jìn)行了深入的功能研究。前人有研究報(bào)道了在酵母中Skpl能參與紡錘體checkpoint的激活及信號(hào)的傳遞，此外，它還在許多關(guān)鍵的細(xì)胞通路中起重要作用，這些結(jié)果提示Skpl可能在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中起相當(dāng)重要的作用。 在本研究中，我們首先構(gòu)建了小鼠激活前后卵細(xì)胞的蛋白譜系。從

2、2D膠上我們得到以下信息：Skpl在激活前后卵細(xì)胞中表達(dá)較多，其表達(dá)量在激活前后無(wú)明顯變化；Skpl在2D膠上呈不同分子量的上下兩排分布，推測(cè)其可能是一種糖基化的修飾。隨后我們運(yùn)用westernblot方法進(jìn)一步驗(yàn)證了Skpl存在于小鼠卵細(xì)胞及孤雌激活卵細(xì)胞中。其表達(dá)情況與2D膠上的情況類似，即表達(dá)量不隨激活而改變，呈不同分子量的上下兩行分布，下面一行蛋白的分子量與理論分子量18700Da較接近。免疫組織化學(xué)的結(jié)果顯示Skpl主要定位于

3、各級(jí)卵母細(xì)胞的胞漿中，另外黃體中也有少量分布。免疫熒光的結(jié)果與免疫組化的結(jié)果類似，skpl主要定位于卵細(xì)胞及各級(jí)胚胎的胞漿中，并且其表達(dá)量及表達(dá)定位隨胚胎發(fā)育不發(fā)生改變。 為研究Skpl蛋白在小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的作用，我們首先構(gòu)建了pEGFP-Skpl-C2超表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)顯微注射的方法將其注射至受精卵原核中然后觀察受精卵的發(fā)育情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組胚胎，超表達(dá)Skpl蛋白的胚胎的發(fā)育受到不同程度的阻滯，有較多的胚胎

4、不能正常致密化而發(fā)育至囊胚階段，以上結(jié)果提示skpl蛋白超表達(dá)能阻滯小鼠早期胚胎的發(fā)育。為進(jìn)一步驗(yàn)證以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們將Skpl抗體注射至受精卵中然后觀察胚胎的發(fā)育情況。結(jié)果顯示受精卵進(jìn)行Skpl抗體注射后其發(fā)育得到了促進(jìn)，在相同的時(shí)間內(nèi)抗體組胚胎的發(fā)育要快于對(duì)照組胚胎的發(fā)育。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了Skpl蛋白的阻斷能促進(jìn)小鼠早期胚胎的發(fā)育，這也與上面超表達(dá)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是一致的。 得到以上的實(shí)驗(yàn)表型，我們接下來(lái)研究Skpl影響小鼠早期

5、胚胎發(fā)育的機(jī)制。前人有研究顯示在酵母中，Skpl能與紡錘體checkpoint蛋白相互作用從而參與紡錘體checkpoint激活與信號(hào)的傳遞，那么Skpl蛋白的阻斷就會(huì)導(dǎo)致這一監(jiān)督機(jī)制的廢除從而使本該被阻止發(fā)育的非正常細(xì)胞能夠繼續(xù)發(fā)育下去。鑒于我們得到的實(shí)驗(yàn)表型與此相符，即skpl抗體阻斷后胚胎的發(fā)育得到促進(jìn)，因此我們進(jìn)一步研究這些注射過(guò)抗體后的胚胎。 首先我們使用免疫熒光的方法觀察經(jīng)過(guò)Skpl抗體注射處理后的卵細(xì)胞和胚胎的紡錘

6、體形態(tài)，結(jié)果顯示卵細(xì)胞經(jīng)過(guò)Skpl抗體注射處理后其紡錘體形態(tài)出現(xiàn)異常的機(jī)率大大提高，異常率接近40％，明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的10.3％和5.4％。紡錘體的異常包括出現(xiàn)多極紡錘體，紡錘絲散亂不規(guī)則，紡錘體形態(tài)畸形甚至出現(xiàn)斷裂。另外，相對(duì)于正常卵細(xì)胞染色體規(guī)則緊密排列于赤道板，注射Skpl抗體后的卵細(xì)胞其染色體出現(xiàn)排列松散紊亂的機(jī)率也有明顯提高。取受精卵進(jìn)行實(shí)驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果，以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示Skpl抗體注射后能明顯提高卵細(xì)胞

7、和受精卵出現(xiàn)紡錘體形態(tài)及染色體排列異常的機(jī)率。同時(shí)我們還進(jìn)行了染色體核型分析實(shí)驗(yàn)，取受精卵進(jìn)行Skpl抗體注射后通過(guò)Giemsa染色的方法觀察染色體的數(shù)目，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射抗體的實(shí)驗(yàn)組胚胎出現(xiàn)非整倍體的機(jī)率相對(duì)于對(duì)照組明顯提高，非整倍體率達(dá)到46.4％，這說(shuō)明Skpl蛋白的阻斷會(huì)誘使胚胎出現(xiàn)非整倍體。在體實(shí)驗(yàn)把處理過(guò)的胚胎移植到假孕母鼠子宮內(nèi)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組平均產(chǎn)仔數(shù)為3.6個(gè)，明顯低于正常對(duì)照組的7個(gè)，仔鼠死亡率也有所上升。通過(guò)以上的實(shí)驗(yàn)，我

8、們發(fā)現(xiàn)Skpl蛋白的阻斷雖然能促進(jìn)胚胎的發(fā)育，但這些發(fā)育得到促進(jìn)的胚胎出現(xiàn)紡錘體形態(tài)染色體排列異常及非整倍體的機(jī)率也明顯提高，從而導(dǎo)致產(chǎn)仔數(shù)降低與新生鼠的死亡。這與前人研究的結(jié)果是一致的，因此我們推測(cè)在哺乳動(dòng)物中Skpl蛋白可能與紡錘體checkpoint蛋白相互作用從而參與紡錘體checkpoint激活及信號(hào)傳遞。 綜上，我們研究了Skpl蛋白在小鼠卵細(xì)胞及胚胎中的定位表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Skpl蛋白的超表達(dá)能阻滯胚胎的發(fā)育，而skpl