單倍體胚胎干細胞在早期胚胎發(fā)育研究中的應(yīng)用.pdf

1、早期胚胎發(fā)育是一個精細而又嚴格的調(diào)控過程，在早期胚胎發(fā)育過程中涉及組蛋白修飾的變化、雌雄基因組互作，甲基化的調(diào)控與變化等。研究早期胚胎發(fā)育機制對發(fā)育生物學以及生殖生物學乃至再生醫(yī)學都具有深遠的意義，因此早期胚胎發(fā)育一直都是人們研究的熱點。因為早期胚胎材料的特殊性，因此人們對于早期胚胎發(fā)育的研究是長久以來的難點，缺乏一種良好的研究工具。
　　單倍體胚胎干細胞(haESCs)是近年來興起的一種新型的胚胎干細胞。其特點是只含有一套染色體

2、組，并且擁有正常胚胎干細胞的特性，具有體外無限增殖以及分化的能力。單倍體胚胎干細胞分為孤雌單倍體胚胎干細胞和孤雄單倍體胚胎干細胞，由于其單倍體來源的多樣性，因此其成為可以模擬單套雌雄基因組的良好細胞系。同時其多能性以及體外無限增殖的特點，為其在體外進行基因操作提供了很多有利的條件，為基因功能研究提供了一種良好的工具。同時，單倍體胚胎干細胞系的建立為研究動物遺傳修飾以及改造提供了新的渠道。
　　從精子與卵母細胞結(jié)合形成受精卵，在整個

3、早期胚胎發(fā)育過程中雌雄基因組互作以及表觀修飾變化一直處于動態(tài)變化之中。但對其基因組互作以及表觀修飾的研究由于早期胚胎操作的難度很高，缺乏有效的研究手段。單倍體胚胎干細胞為這種雌雄基因組互作提供了一種新的研究手段。
　　基因組印記的變化是整個生命過程中最重要的生物學現(xiàn)象之一。印記基因是個體發(fā)育的重要保證，對于印記基因的研究由于其材料的特殊性難于收集，也造成了印記基因的研究方式單一，且研究困難。單倍體胚胎干細胞便于基因操作，因此成為研

4、究印記基因的良好素材。
　　本研究通過孤雌激活的方法獲得孤雌單倍體胚胎干細胞，同時利用精子克隆的辦法獲得孤雄單倍體胚胎干細胞，隨后對孤雌和孤雄胚胎干細胞進行檢測，發(fā)現(xiàn)其具有正常的單倍體核型，同時也具有正常的胚胎干細胞的多能性特征。隨后我們利用孤雌和孤雄單倍體胚胎干細胞作為工具進行早期胚胎發(fā)育的研究。
　　首先，利用孤雌孤雄單倍體胚胎干細胞進行細胞融合，進行四倍體補償實驗，來研究早期胚胎囊胚期前雌雄基因組互作對動物到期發(fā)育是否

5、必要。成功地獲得了孤雌與孤雄融合的胚胎干細胞細胞系。該細胞系具備正常二倍體核型，同時其具有體外分化成三胚層以及二倍體種系嵌合的能力，證明其具備正常的ES細胞的多能性。最后利用四倍體補償實驗，獲得四倍體到期小鼠，該實驗是細胞多能性最高級別驗證的黃金標準，同時該實驗也證明了在囊胚期前，雌雄基因組互作對動物到期發(fā)育不是必需的。
　　其次，發(fā)現(xiàn)孤雌單倍體胚胎干細胞具有隨著細胞代次增高DNA甲基化修飾不斷降低的特性，尤其是其印記調(diào)控區(qū)也存在

6、這樣的現(xiàn)象，同時孤雌單倍體胚胎干細胞胞質(zhì)注射小鼠由于印記異常等原因只能發(fā)育到E13.5天。孤雌單倍體胚胎干細胞的這些特性為印記基因的功能性研究提供了一種良好的工具，通過對孤雌單倍體胚胎干細胞不同印記區(qū)域進行修飾，來進行印記對早期胚胎發(fā)育的影響。通過對IGDMR的印記DMR區(qū)域的同源打靶獲得了IGDMR區(qū)域基因沉默的孤雌單倍體胚胎干細胞，該細胞支持動物到期發(fā)育，但影響其成活。隨后，在IGDMR區(qū)域修飾的基礎(chǔ)上，對H19區(qū)域進行同源重組，通

7、過對H19轉(zhuǎn)錄起始位點上游-4kb到+1kb以及-10kb到+4kb區(qū)域敲除我們發(fā)現(xiàn)，在IGDMR/△5kbH19敲除的單倍體胚胎干細胞胞質(zhì)注射后不能獲得到期成活的小鼠，但IGDMR/△15kbH19敲除的單倍體胚胎干細胞胞質(zhì)注射不僅動物到期率有所提高而且動物可以成活到成年，但是其體重及行為學與野生型相比依舊有所異常。最后，我們通過在IGDMR/△15kbH19敲除的單倍體胚胎干細胞的基礎(chǔ)上進行IGF2過表達形成IGDMR/△15kbH