雞早期胚胎發(fā)育規(guī)律和干細(xì)胞培養(yǎng)及其轉(zhuǎn)基因的研究.pdf

1、隨著雞胚胎和遺傳工程的快速發(fā)展，迫切需要雞胚胎發(fā)育規(guī)律的統(tǒng)一判斷依據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)，以及對(duì)雞早期胚胎在體內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律和早期胚胎細(xì)胞體外生長(zhǎng)能力的掌握。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)雞早期胚胎發(fā)育研究，以探索雞胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的規(guī)律性；采用不同方法分離雞胚胎干(ES)細(xì)胞，同時(shí)觀察雞ES細(xì)胞對(duì)不同酶消化的耐受性、ES細(xì)胞體外培養(yǎng)和傳代的能力；采用顯微注射法將人生長(zhǎng)激素(hGH)基因和人組織激肽釋放酶(KLK1)基因直接注入發(fā)育雞胚的胚盤中，研究ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源基因

2、的能力，為禽類胚胎發(fā)育生物學(xué)研究以及轉(zhuǎn)基因雞生產(chǎn)提供素材和新途徑。研究結(jié)果如下： 1、雞早期胚胎體內(nèi)發(fā)育規(guī)律的研究：在雞產(chǎn)蛋后的不同時(shí)間段內(nèi)分別將雞處死，從輸卵管或子宮內(nèi)取出發(fā)育的受精卵，顯微鏡下觀察并記錄。結(jié)果顯示：受精卵的第一次分裂發(fā)生在產(chǎn)蛋后5h(0-0.5h子宮齡)，桑椹期形成在產(chǎn)蛋后11.5h(6-6.5h子宮齡)，囊胚期形成在產(chǎn)蛋后15.5h(10-10.5子宮齡)。根據(jù)胚盤形態(tài)發(fā)育的變化，可將雞胚在體內(nèi)發(fā)育過程分為

3、兩個(gè)時(shí)期：一是在距前一個(gè)蛋產(chǎn)出后5.5h(0-1h子宮齡)至15.5h(10-10.5h子宮齡)為雞胚的卵裂期，卵裂的結(jié)果形成厚約6-7層細(xì)胞的胚層；二是在距前一個(gè)蛋產(chǎn)出后17.5h(12-12.5h子宮齡)至明區(qū)形成期，即鳥類的囊胚期，結(jié)果在胚盤中央形成透明的周圍不透明的明區(qū)和暗區(qū)。對(duì)雞ES細(xì)胞培養(yǎng)或制作嵌合體雞，根據(jù)需要可在不同的時(shí)間獲取所需卵裂球或胚胎，早期囊胚階段即在分裂期的10.5h子宮齡前可獲取較大卵裂球，在12.5-13.

4、5h子宮齡后可獲取較小的卵裂球。 2、對(duì)雞ES細(xì)胞分離與培養(yǎng)的研究：采用藥勺獲取、單獨(dú)酶解離法分離得到的雞第Ⅹ期(24-26h子宮齡)胚盤細(xì)胞，接種到四種不同的培養(yǎng)體系中，比較不同的培養(yǎng)體系中各種因素對(duì)ES細(xì)胞培養(yǎng)傳代的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在無飼養(yǎng)層，培養(yǎng)液中不添加外源性細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系1中，無ES細(xì)胞的AKP陽性克隆形成；在無飼養(yǎng)層，培養(yǎng)液中添加細(xì)胞因子培養(yǎng)體系2中，培養(yǎng)72h后有一代ES細(xì)胞的AKP陽性克隆形成，克隆形成率

5、為33.33﹪，但ES細(xì)胞在傳代后不能重新聚集形成集落；在以雞胚胎成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層，培養(yǎng)液中不添加外源性細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系3中，培養(yǎng)48h后可見細(xì)胞成集落狀隆起生長(zhǎng)，但傳至三代后未觀察到ES細(xì)胞集落形成，第一代和二代ES細(xì)胞的AKP陽性克隆形成率分別為40﹪和20﹪。與其它三個(gè)培養(yǎng)體系相比，在以雞成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層，用添加了10﹪的胎牛血清、2﹪的雞血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5.5×10-5mol/Lβ

6、-巰基乙醇、10μ1/ml非必需氨基酸、以及1000U/ml白血病抑制因子(Leukemiainhibitoryfactor,LIF)、10ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子(Fibroblastgrowthfactor-basic，bFGF)和5ng/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Stemcellfactor,SCF)的高糖DMEM培養(yǎng)體系4中，培養(yǎng)約2～3d時(shí)開始出現(xiàn)鳥巢狀的ES細(xì)胞集落，以多次離散法進(jìn)行傳代獲得了傳至5～6代的雞ES細(xì)胞克隆。AK

7、P陽性克隆形成率與其它三個(gè)培養(yǎng)體系相比，存在著極顯著的差異(P＜0.01)。通過對(duì)傳代培養(yǎng)后的雞ES細(xì)胞進(jìn)行AKP染色鑒定和SSEA-1的鑒定，證實(shí)細(xì)胞未發(fā)生分化，保持了ES細(xì)胞的特征。 3、對(duì)雞胚盤內(nèi)轉(zhuǎn)染外源基因的研究：采用顯微注射法，分別將人生長(zhǎng)激素(hGH)基因和人組織激肽釋放酶(KLK1)基因直接注射到孵化24h的雞胚中繼續(xù)孵化。在注射的320枚雞胚中，孵化前7d死亡194枚，8～18d死亡108枚，孵出雛雞18只，孵出

8、率為5.6﹪。8只雛雞分別于出殼后的第一、二、三、五天死亡。7只于3月齡死亡。3只雞存活并正常生長(zhǎng)。死亡雛雞具有腳癱、體弱、斜頸、站立不穩(wěn)等異常表現(xiàn)，存活雞無外觀異常。從孵化4d后死亡的150枚雞胚和18只出殼雛雞的組織中提取基因組DNA，并用DNA雜交試驗(yàn)進(jìn)行基因整合檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中的3枚雞胚和3只雛雞為人生長(zhǎng)激素基因整合陽性，基因整合率為12.5﹪；18枚雞胚和6只雛雞為KLK1整合陽性，整合率為22.2﹪。結(jié)果表明：雞胚盤內(nèi)細(xì)胞