人胚胎干細(xì)胞建系、初步鑒定及應(yīng)用不同方法冷凍人胚胎干細(xì)胞的研究.pdf

1、人胚胎干細(xì)胞(hESCs)是指來源于人囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)或人原始生殖細(xì)胞(imordial germ cells)的多能性細(xì)胞，它在體外能無限增殖并保持正常的細(xì)胞核型，具有分化為三個(gè)胚層的各種組織的潛能。hESCs系的建立對(duì)再生醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)及基礎(chǔ)科學(xué)研究具有深遠(yuǎn)的應(yīng)用價(jià)值。目前，許多研究機(jī)構(gòu)都在進(jìn)行hESC建系的相關(guān)研究工作。大多數(shù)生殖中心在進(jìn)行體外受精．胚胎移植(IVF-ET)時(shí)通常使用D<,3>的胚胎進(jìn)行移植，移植后常有許多剩余

2、質(zhì)量差的廢棄胚胎，將這些D<,3>廢棄胚胎收集起來進(jìn)行培養(yǎng)，部分胚胎可發(fā)育成囊胚，本實(shí)驗(yàn)利用這些囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，以人胚胎肺組織成纖維細(xì)胞(HEPFs)作為飼養(yǎng)層，進(jìn)行了hESC建系及鑒定的初步研究。還有一部分患者已妊娠分娩成功，她們自愿簽署知情同意書，將其多余的冷凍胚胎用于科學(xué)研究，本實(shí)驗(yàn)將這些胚胎解凍后進(jìn)行培養(yǎng)，部分也可發(fā)育成囊胚，對(duì)其也進(jìn)行了hESCs建系及鑒定的相關(guān)研究。hESCs建系成功后的另一個(gè)重要環(huán)節(jié)就是細(xì)胞的有效凍存，本實(shí)

3、驗(yàn)采用慢速冷凍、玻璃化冷凍及程序降溫冷凍三種不同方法凍存同一代數(shù)的hESCs，并將解凍后hESCs的細(xì)胞復(fù)蘇率、克隆生長(zhǎng)及分化情況進(jìn)行對(duì)比分析，同時(shí)對(duì)解凍后的hESCs的全能性進(jìn)行了鑒定。 第一部分，應(yīng)用體外受精廢棄胚胎建立hESCs系；第二部分，對(duì)所建立hESCs系的鑒定；第三部分，hESCs低溫凍存方法比較。 本實(shí)驗(yàn)共收集了177個(gè)D3廢棄胚胎，形成囊胚47個(gè)；解凍胚胎23個(gè)，形成囊胚7個(gè)。hESCs系的建立與囊胚的

4、質(zhì)量和ICM所形成的原代克隆的生長(zhǎng)情況密切相關(guān)，質(zhì)量好的囊胚分離培養(yǎng)獲得的hESCs傳代效率高，原始生長(zhǎng)速度快的ICM所形成的原代克隆傳代效率高。將來源于優(yōu)質(zhì)囊胚的ICM接種于飼養(yǎng)層后已經(jīng)建立了4個(gè)hESCs系，分別命名為hESCs-060909、 hESCs-060927、hESCs-061005和hESCs-061124，其中hESCs-061124來源于解凍胚胎形成的優(yōu)質(zhì)囊胚。 hESCs系的鑒定包括對(duì)hESCs的細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)

5、記物(alkaline phosphatase， TRA-1-60，TRA-1-81，SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4)及核型的鑒定。對(duì) hESCs-060909 P<,20>，hESCs-060927P<,15>，hESCs-061124 P<,6>進(jìn)行了AKP檢測(cè)，克隆呈紫紅色陽(yáng)性反應(yīng)。對(duì)hESCs-060909 P<,20>和hESCs-060927 P<,15>進(jìn)行了免疫組化檢測(cè)：未分化的hESCs克隆SSEA-1不著色

6、，呈陰性反應(yīng)；SSEA-3染色較淺，呈部分陽(yáng)性反應(yīng)；SSEA-4染色深，呈陽(yáng)性反應(yīng)；TRA-1-60呈陽(yáng)性反應(yīng)。對(duì) hESCs-060909 P<,20>進(jìn)行了核型檢測(cè)，核型為46，XY，表明其具有正常的二倍體核型；對(duì)hESCs-060927 P<,15>進(jìn)行了核型檢測(cè)，核型為46，XX，表明其具有正常的二倍體核型。 本實(shí)驗(yàn)探討了三種不同方法冷凍保存hESCs的效率。將傳統(tǒng)慢速冷凍、玻璃化冷凍及程序降溫冷凍三種方法凍存的hESC

7、s解凍后進(jìn)行比較，分析了不同方法對(duì)hESCs的細(xì)胞復(fù)蘇率、克隆生長(zhǎng)和分化情況的影響。用機(jī)械法將培養(yǎng)皿中同一細(xì)胞系同代的hESCs進(jìn)行分離，共獲得93個(gè)相似大小的hESCs細(xì)胞團(tuán)塊，將其分為三組凍存：31個(gè)進(jìn)行慢速冷凍，31個(gè)進(jìn)行玻璃化冷凍，其余31個(gè)進(jìn)行程序化冷凍。一周后將凍存的hESCs解凍，對(duì)不同凍存方法的hESCs復(fù)蘇率(復(fù)蘇率=回收細(xì)胞團(tuán)塊數(shù)目/冷凍細(xì)胞團(tuán)塊數(shù)目)進(jìn)行對(duì)比：玻璃化法組復(fù)蘇率為35.5％，程序化冷凍組復(fù)蘇率為16.

8、1％，慢速冷凍組的復(fù)蘇率為12.9％。其中玻璃化法組與慢速冷凍組相比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為玻璃化法能更有效的保存人胚胎干細(xì)胞。其余兩兩比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。也將應(yīng)用三種凍存方法解凍后的hESCs的細(xì)胞形態(tài)，克隆生長(zhǎng)和分化情況進(jìn)行了對(duì)比，玻璃化法組比其它兩組的hESCs形態(tài)好，克隆生長(zhǎng)速度較快且不易分化。最后，對(duì)解凍后的hESCs的全能性進(jìn)行了鑒定，三組解凍后的hESCs核型分析正常，AKP陽(yáng)性，SSEA-1陰性，SSEA-3部分陽(yáng)性，S