實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠視覺功能損傷的機(jī)制研究.pdf

1、目的:動(dòng)態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmuneencephalomyelitis，EAE)小鼠視網(wǎng)膜多巴胺能無長突細(xì)胞(dopaminergic amacrine cell，DAC)、眼特化區(qū)域分離(eye-specific segregation)和離視網(wǎng)膜投射的變化結(jié)合病理學(xué)、分子生物學(xué)等方法，研究EAE小鼠發(fā)病期視覺功能障礙的可能機(jī)制。
　　 方法: C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為對(duì)

2、照組（20只）和EAE組(50只)。首先參照MendelⅠ造模方法并加以改進(jìn)，采用短肽鏈的髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55(MOG35-55)作為抗原誘導(dǎo)C57BL/6小鼠EAE模型。自免疫當(dāng)天開始觀察記錄小鼠基本情況，根據(jù)Webster等[15]分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。其次EAE組再隨機(jī)分為5個(gè)亞組，每個(gè)亞組10只，各個(gè)亞組小鼠在抗原免疫后13d、18d、23d、28d、38d進(jìn)行雙眼玻璃體內(nèi)熒光染料注射，左眼注射Alexa-

3、488（綠），右眼注射Alexa-555（紅），注射量均為1.5ul。各組小鼠染料注射完成48h后，即抗原免疫后15d、20d、25d、30d、40d處死，取小鼠視神經(jīng)切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色和Luxol FastBule髓鞘染色后光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化，統(tǒng)計(jì)視神經(jīng)炎發(fā)病率;取腦組織固定后置于熒光顯微鏡下觀察球后視通路、LGN和SC的變化情況;觀察并記錄整體觀情況后，瓊脂包埋腦組織振動(dòng)切片機(jī)

4、切片，收集LGN部分異側(cè)投射面積最大的3片和SC部分最靠近中線的4片，在熒光顯微鏡下觀察眼特化區(qū)域分離情況并攝片，利用Matlab圖象分析軟件進(jìn)行圖像處理并計(jì)算切片的同側(cè)(ipsilateral)眼睛軸突投射面積、同側(cè)(ipsilateral)和異側(cè)(contralateral)投射區(qū)域重疊的面積。用免疫熒光染色檢測視網(wǎng)膜各時(shí)間點(diǎn)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)表達(dá)，計(jì)數(shù)多巴胺能無長突細(xì)胞(dopamine

5、rgic amacrine cell,DAC)數(shù)目。
　　 結(jié)果:
　　 1、EAE組小鼠臨床發(fā)病率96％，高峰癥狀評(píng)分(3.53±0.75)分，視神經(jīng)炎發(fā)病率77.1％（病理診斷）。
　　 2、EAE小鼠雙眼特化區(qū)域分離障礙。LGN雙眼特化區(qū)域分離結(jié)果:免疫后15d，EAE組雙側(cè)投射重疊面積與Saline組均無明顯差異;免疫后20、25、30d EAE組雙側(cè)投射重疊面積與Saline相比均顯著增加;SC雙眼特化

6、區(qū)域分離結(jié)果:免疫后20d開始EAE組雙側(cè)投射重疊面積較Saline組顯著增加，25d達(dá)最高值(P=0.0012)。
　　 3、EAE小鼠視網(wǎng)膜DACs減少:同Saline組相比，免疫后20d，EAE小鼠DACs數(shù)目開始減少;25d時(shí)與Saline組有顯著性差異。
　　 4、EAE小鼠球后視通路損傷:EAE組免疫后15、20、25、30d，腦組織整體觀視通路顯示正常，SC、LGN均清楚可見。免疫后40d，SC可見，4只小

7、鼠LGN僅殘留部分可見，1只LGN完全缺失，1只顯示正常。發(fā)生ON的EAE小鼠中，免疫40d時(shí)，第一視通路損傷發(fā)生率83.33％。
　　 結(jié)論:
　　 1、MOG35-55誘導(dǎo)C57BL/6小鼠EAE模型，發(fā)病率高，重復(fù)性好，視神經(jīng)病理損傷明顯，是研究ON和MS的理想模型。
　　 2、EAE小鼠視覺功能損傷主要由兩方面所致:
　　 ①發(fā)病早期視覺信息處理障礙;②中后期視覺信號(hào)傳遞受阻。
　　 3、