雞消化道乳酸桿菌的黏附研究.pdf

1、本研究利用掃描和透射電鏡對(duì)健康與患球蟲(chóng)(柔嫩艾美耳球蟲(chóng))病雞消化道中不同部位正常菌群黏附狀況進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，健康雞消化道(嗉囊、回腸和盲腸部位)粘膜表面均勻覆蓋著大量的正常菌群，尤其嗉囊表面黏附著致密的乳酸桿菌。并對(duì)乳酸桿菌黏附消化道上皮細(xì)胞的狀態(tài)情況進(jìn)行了觀察；選取了高粘附性乳酸桿菌菌株(SDnA、SDnB7和SDnE1)；確定了乳酸桿菌SDnA株黏附消化道上皮細(xì)胞黏附因子性質(zhì)；對(duì)乳酸桿菌SDnA株粘附配體蛋白和雞消化道上皮細(xì)胞受

2、體蛋白，進(jìn)行了提取、純化與鑒定；制備了兔抗雞乳酸桿菌SDnA株黏附配體和上皮細(xì)胞受體蛋白血清；在此基礎(chǔ)上測(cè)定了不同日齡和病雞消化道中乳酸桿菌黏附配體和受體蛋白的含量；最后確定了影響乳酸桿菌粘附消化道上皮細(xì)胞的不同條件。本研究共分九部分。 第一部分健康與患病雞消化道中正常菌分布變化超微觀察利用掃描電鏡對(duì)健康與患球蟲(chóng)(柔嫩艾美耳球蟲(chóng))病雞消化道中正常菌群黏附狀況進(jìn)行了觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，健康雞消化道(嗉囊、回腸和盲腸部位)粘膜表面均勻覆

3、蓋著大量的正常菌群，尤其嗉囊表面黏附著致密的乳酸桿菌。回腸部位正常菌多而粘膜完整。而患球蟲(chóng)病雞消化道(嗉囊、回腸和盲腸部位)粘膜已脫落，正常菌群數(shù)量明顯減少。 第二部分乳酸桿菌黏附消化道上皮細(xì)胞狀態(tài)超微觀察用掃描電鏡對(duì)健康雞嗉囊黏膜表面正常菌群與黏膜上皮細(xì)胞結(jié)合的狀態(tài)進(jìn)行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嗉囊黏膜表面覆蓋著大量的乳酸桿菌，其表面以偽足樣絲狀物與嗉囊黏膜細(xì)胞緊密結(jié)合。同時(shí)用透射電鏡對(duì)乳酸桿菌粘附CaCo-2cell的狀態(tài)進(jìn)行了觀察

4、，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞與乳酸桿菌相結(jié)合后其結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化，菌體結(jié)構(gòu)完整。 第三部分宿主特異性高粘附性乳酸桿菌菌株篩選的研究選取5株雞消化道乳酸桿菌株，分別與CaCo-2、MDCK、CEFcell結(jié)合3h和24h，觀察其黏附性。結(jié)果表明，不同菌株與三種細(xì)胞的黏附效果不同。其中乳酸桿菌菌株SDnB7、SDnE1和SDnA黏附CaCo-2cell效果較好，而SDnA與SDnB1株黏附CEFcell效果較好，乳酸桿菌對(duì)MDCKcell幾乎

5、不黏附；菌株的培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)其黏附CaCo-2cell效果的影響試驗(yàn)表明，培養(yǎng)2d的乳酸桿菌黏附性較好；乳酸桿菌與CaCo-2cell作用24h比作用3h黏附菌數(shù)多；不同菌株濃度(108、107、106、105和104個(gè)/ml)對(duì)CaCo-2cell的黏附程度不同。108組的細(xì)胞黏附菌株數(shù)量較多。 第四部分乳酸桿菌黏附腸道上皮細(xì)胞黏附因子性質(zhì)的研究乳酸桿菌依靠表面的黏附物質(zhì)黏附于腸道上皮細(xì)胞上。為了進(jìn)一步確定黏附因子性質(zhì)，試驗(yàn)首

6、先取乳酸桿菌SDnA株培養(yǎng)液上清經(jīng)不同濃度胰蛋白酶、牛血清白蛋白和加溫100℃，10min處理，進(jìn)行黏附試驗(yàn)，觀察乳酸桿菌SDnA株表面粘附配體性質(zhì)；另外取腸道上皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)碘酸鈉、胰蛋白酶處理和各種糖抑制試驗(yàn)確定細(xì)胞上乳酸桿菌粘附受體的性質(zhì)。結(jié)果表明，SDnA株表面粘附配體是一種蛋白質(zhì)；腸道上皮細(xì)胞上乳酸桿菌SDnA株粘附受體是一種糖蛋白，D-甘露糖蛋白。正常乳酸桿菌能夠凝集酵母菌細(xì)胞，甘露糖處理乳酸桿菌后，其與酵母菌細(xì)胞無(wú)凝集反應(yīng)或減

7、弱。表明酵母菌細(xì)胞上乳酸桿菌SDnA株黏附受體與甘露糖有關(guān)。另外研究也表明死菌與活菌具有相同的黏附細(xì)胞的能力。 第五部分乳酸桿菌粘附配體蛋白的提取、純化與鑒定利用分離自SPF雞消化道的高黏附性乳酸桿菌SDnA株進(jìn)行乳酸桿菌粘附配體蛋白的提取、純化與鑒定。采用氯化鋰和硫酸銨對(duì)比的蛋白質(zhì)提取方法、蛋白質(zhì)柱層析法、不連續(xù)活性-PAGE純化技術(shù)以及黏附試驗(yàn)，對(duì)乳酸桿菌黏附配體蛋白進(jìn)行了提取、純化與鑒定研究。經(jīng)過(guò)純化，在不連續(xù)活性-PAG

8、E凝膠上均出現(xiàn)了單一而清晰的條帶，其分子量約為43-66KDa。將該提取純化的蛋白預(yù)先與乳酸桿菌SDnA株混合作用后，可明顯增強(qiáng)上皮細(xì)胞與該乳酸桿菌的結(jié)合，證明該純化蛋白即為乳酸桿菌SDnA株的黏附配體蛋白。另外，用透射電鏡對(duì)乳酸桿菌表面黏附蛋白被提取前后的形態(tài)變化進(jìn)行了觀察，結(jié)果表明，細(xì)菌被提取蛋白后，細(xì)菌細(xì)胞壁變薄、透明、凹凸不平，黏附性較低。而未提取蛋白的細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)正常。表明乳酸桿菌黏附蛋白是一種菌體表面蛋白。第六部分乳酸桿菌黏

9、附受體蛋白的提取、純化與鑒定 采集成年SPF雞的消化道黏膜液，通過(guò)蛋白質(zhì)分離層析、不連續(xù)活性-PAGE、腸道上皮細(xì)胞培養(yǎng)及乳酸桿菌黏附抑制試驗(yàn)技術(shù)，對(duì)上皮細(xì)胞上乳酸桿菌SDnA株黏附受體蛋白進(jìn)行了提取、純化與鑒定。經(jīng)純化，在不連續(xù)活性-PAGE電泳凝膠上出現(xiàn)了單一而清晰的條帶，其分子量約為60KDa；將該提取純化的蛋白預(yù)先與乳酸桿菌SDnA株混合作用后，可明顯抑制上皮細(xì)胞與該乳酸桿菌的結(jié)合，證明該純化蛋白即為腸道上皮細(xì)胞表面乳酸

10、桿菌SDnA株的黏附受體蛋白。 利用純化的SPF雞腸道上皮細(xì)胞上乳酸桿菌SDnA株黏附受體和配體蛋白制備兔抗雞乳酸桿菌SDnA株黏附配體與受體蛋白血清。 第七部分不同日齡及病雞消化道乳酸桿菌黏附配體蛋白含量研究利用兔抗雞乳酸桿菌SDnA株黏附配體蛋白血清，以不連續(xù)活性-PAGE和間接ELISA方法，對(duì)不同日齡、健康和患球蟲(chóng)病雞消化道不同部位(嗉囊與小腸)乳酸桿菌SDnA株黏附配體蛋白含量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明2日齡雞嗉囊部

11、位產(chǎn)生乳酸桿菌粘附配體蛋白成分，OD450nm值為0.181(陽(yáng)性值，P/N＞2)，1日齡雞小腸部位產(chǎn)生該成分，OD450nm值為0.168(陽(yáng)性值，P/N＞2)，5日齡雞嗉囊與小腸部位配體蛋白成分達(dá)到穩(wěn)定，OD450nm值分別為0.200和0.123(陽(yáng)性值，P/N＞2)?；记蛳x(chóng)病雞體內(nèi)嗉囊與小腸部位配體蛋白含量比健康雞明顯減少。OD450nm值分別為：嗉囊，0.132(陰性值，P/N＜2)和0.143(陽(yáng)性值，P/N＞2)；小腸，0

12、.134(陰性值，P/N＜2)和0.148(陽(yáng)性值，P/N＞2)。 第八部分不同日齡及病雞消化道乳酸桿菌黏附受體蛋白含量研究利用兔抗雞消化道上皮細(xì)胞上乳酸桿菌SDnA株受體蛋白血清，以瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、不連續(xù)活性-PAGE和間接ELISA方法，對(duì)不同日齡、健康和患球蟲(chóng)病雞消化道不同部位(嗉囊與腸道)乳酸桿菌SDnA株黏附受體蛋白含量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，1日齡雞嗉囊與小腸部位產(chǎn)生乳酸桿菌粘附受體蛋白成分，OD450nm值分別為0.2

13、36和0.176(陽(yáng)性值，P/N＞2)，5日齡后嗉囊與小腸部位受體蛋白成分達(dá)到穩(wěn)定，OD450nm值分別為0.231和0.166(陽(yáng)性值，P/N＞2)。患球蟲(chóng)病雞體內(nèi)嗉囊與小腸部位上皮細(xì)胞上乳酸桿菌黏附受體蛋白含量比健康雞明顯減少。OD450nm值分別為：嗉囊，0.164、0.181(陽(yáng)性值，P/N＞2)；小腸，0.161、0.180(陽(yáng)性值，P/N＞2)。 第九部分影響乳酸桿菌粘附腸道上皮細(xì)胞的條件研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，觀

14、察乳酸桿菌在不同條件下，如pH值、溫度、離子濃度(如Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、S2-、I-、VB5)、致病性大腸桿菌及乳酸桿菌黏附配體蛋白，黏附腸上皮細(xì)胞以及抑制致病性大腸桿菌黏附腸上皮細(xì)胞的能力。取24孔板(放入蓋玻片)，每孔加入一定量細(xì)胞培養(yǎng)貼壁后，各孔分別加入不同條件下菌株200ul，在溫箱中放置24小時(shí)，觀察不同條件下菌株的粘附性。結(jié)果表明：乳酸桿菌與腸上皮細(xì)胞的最佳結(jié)合的適宜酸堿度、溫度分別為pH6-7

15、、37℃-42℃；Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、VB5離子濃度分別為2mM、2.0mM、0.005mM、0.0005mM、0.0025mM和0.0015mM。S2-與I-的濃度值對(duì)黏附性影響不顯著；致病性大腸桿菌和乳酸桿菌與腸上皮細(xì)胞一起培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌的粘附能力與對(duì)照組相比受到明顯的抑制(P＜0.01)。還發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌能阻止致病性大腸桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的入侵，乳酸桿菌存在的條件下，致病性大腸桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附