?；撬釋?duì)急性缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷防護(hù)效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、高原是指海拔超過(guò)3000米的地區(qū)，在這樣的高度，大氣壓和氧分壓低，即環(huán)境性缺氧，對(duì)進(jìn)駐高原的人可造成供氧不足，為了適應(yīng)此缺氧環(huán)境，人體器官的生理功能會(huì)發(fā)生改變。急進(jìn)高原時(shí)有80％～90％的人會(huì)出現(xiàn)不同程度的高原反應(yīng)，嚴(yán)重情況下甚至誘發(fā)高山病(altitudeillness，AI)。對(duì)視覺(jué)的影響主要表現(xiàn)在：暗適應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，視力下降，色覺(jué)減退，甚至出現(xiàn)視網(wǎng)膜出血，引起高原視網(wǎng)膜病(high-altituderetinopathy，HAR)。

2、HAR最初表現(xiàn)為血管擴(kuò)張、出血，嚴(yán)重的導(dǎo)致視功能障礙、失明，有的在回到平原后仍不能恢復(fù)正常。 視網(wǎng)膜外層由毛細(xì)血管供氧，內(nèi)層的氧供給需要Müller細(xì)胞參與。Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜中主要的膠質(zhì)細(xì)胞，其胞核位于視網(wǎng)膜內(nèi)核層(innernuclearlayer，INL)，突起則自外界膜縱向伸展，穿過(guò)整個(gè)視網(wǎng)膜至內(nèi)界膜，在內(nèi)外界膜處構(gòu)成血-視網(wǎng)膜屏障。因此，Müller細(xì)胞在視網(wǎng)膜物質(zhì)、能量供給和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中擔(dān)任重要角色。缺氧可導(dǎo)致

3、Müller細(xì)胞功能全面下降，引起內(nèi)環(huán)境失穩(wěn)。一方面，缺氧可引起視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元興奮毒性增強(qiáng)，興奮性谷氨酸的持續(xù)作用影響視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞特別是節(jié)細(xì)胞功能，最終觸發(fā)節(jié)細(xì)胞的凋亡或死亡，阻斷視覺(jué)信號(hào)傳遞。Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜谷氨酸濃度的調(diào)節(jié)單元，通過(guò)胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要是谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glutamatetransporter1，GLAST)攝取突觸間過(guò)多的谷氨酸，由谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，GS)

4、轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)興奮性的谷氨酰胺。谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)是電壓及K+依賴性的，谷氨酸攝入細(xì)胞的同時(shí)K+向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)。缺氧時(shí)胞外K+濃度升高，谷氨酸的攝入受到抑制。Müller細(xì)胞可通過(guò)內(nèi)向整流鉀通道(inwardlyrectifyingK+channel，Kir)Kir4.1清除胞外多余的K+，從而減弱高K+濃度對(duì)谷氨酸攝入的抑制。但急性缺氧時(shí)Müller細(xì)胞的谷氨酸攝取和代謝路徑發(fā)生了怎樣的變化，目前尚缺乏深入研究。另一方面，當(dāng)刺激到來(lái)時(shí)，組織具有一定的

5、自我防御能力，促進(jìn)機(jī)體快速建立缺氧適應(yīng)是應(yīng)對(duì)缺氧的重要途徑，通過(guò)增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxiainduciblefactor1，HIF-1)表達(dá)能有效改善缺氧反應(yīng)。HIF-1是缺氧耐受因子，能激活多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，增加供氧、提高代謝，反映出機(jī)體對(duì)缺氧的適應(yīng)調(diào)節(jié)能力。存在于視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucosetransporter1，GLUT-1)為其下游調(diào)控基因之一。HIF-1是否參與了視網(wǎng)膜缺氧適應(yīng)調(diào)節(jié)目前尚無(wú)

6、報(bào)道。 ?；撬?2-氨基乙磺酸，taurine，Tau)屬于含硫氨基酸，為人體條件必需氨基酸，不參與蛋白質(zhì)合成，在體內(nèi)游離存在或在一些簡(jiǎn)單肽類(lèi)中存在。牛磺酸是視網(wǎng)膜中含量最豐富的氨基酸之一，具有抗氧化、膜穩(wěn)定、調(diào)節(jié)滲透壓等多種功能。嬰兒缺乏牛磺酸導(dǎo)致視網(wǎng)膜電圖異常，眼底可見(jiàn)視網(wǎng)膜色素上皮出現(xiàn)輕微顆粒。敲除?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的老鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的視網(wǎng)膜變性。在應(yīng)激狀態(tài)下?；撬嵩谕挥|間的釋放增加也可能引起視網(wǎng)膜細(xì)胞中的?；撬崛狈Γ?dāng)視網(wǎng)

7、膜細(xì)胞中的?；撬峤档蜁r(shí)，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化。以往研究發(fā)現(xiàn)牛磺酸對(duì)心肌缺氧具有明顯的保護(hù)作用。另有研究顯示，?；撬釋?duì)糖尿病視網(wǎng)膜病(diabeticretinopathy，DR)的谷氨酸重?cái)z系統(tǒng)有促進(jìn)作用。牛磺酸是否也能在高原急性缺氧下通過(guò)類(lèi)似作用防護(hù)視網(wǎng)膜損傷，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)研究。 基于以上分析，推測(cè)，?；撬峥赡苁且环N理想的視覺(jué)缺氧損傷防護(hù)劑。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以SD大鼠為研究對(duì)象，2.4％?；撬峤?jīng)口攝入進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)干預(yù)，利用低壓氧艙

8、模擬4500米和5500米高原1～3天急性缺氧條件，體外實(shí)驗(yàn)分別以原代混養(yǎng)視網(wǎng)膜細(xì)胞和純化視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞制備細(xì)胞缺氧模型。通過(guò)免疫組織化學(xué)、酶組織化學(xué)、氨基酸分析、免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞技術(shù)、激光共聚焦分析技術(shù)、RT-PCR、Westernblotting等實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，首次在體內(nèi)觀察急性持續(xù)性缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能損傷及?；撬岬姆雷o(hù)效應(yīng)，并在體外進(jìn)一步研究缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜Müller功能改變及牛磺酸的防護(hù)作用，從Mülle

9、r細(xì)胞谷氨酸清除路徑和缺氧適應(yīng)路徑兩個(gè)方面深入探討牛磺酸對(duì)視網(wǎng)膜缺氧損傷防護(hù)作用可能的分子機(jī)制。 主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.模擬4500米和5500米高原缺氧主要對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)層細(xì)胞造成影響。視網(wǎng)膜內(nèi)網(wǎng)狀層(innerplexiformlayer，IPL)、節(jié)細(xì)胞層(ganglioncelllayer，GCL)出現(xiàn)腫脹，超微結(jié)構(gòu)顯示，Müller細(xì)胞出現(xiàn)線粒體脫嵴、腫脹變性。含2.4％?；撬岬臓I(yíng)養(yǎng)飼料預(yù)先干預(yù)一周，大鼠視網(wǎng)膜

10、內(nèi)層腫脹程度和超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕。Müller細(xì)胞在中度缺氧早期向IPL移行，有利于保護(hù)內(nèi)層神經(jīng)細(xì)胞，?；撬崮艽龠M(jìn)Müller細(xì)胞的移行，增強(qiáng)其保護(hù)作用。 2.在原代混養(yǎng)的SD大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞中，神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞共生良好，神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺氧更敏感，缺氧后其存活率下降到8％，在培養(yǎng)介質(zhì)中預(yù)先加入0.1mmol/L、1mmol/L和10mmol/L的牛磺酸可使其存活率上升到36.2％、73.4％和55.7％，1mmol/L牛磺酸對(duì)提高

11、存活率效果最顯著。提示牛磺酸促進(jìn)體外缺氧培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞存活。 3.缺氧降低Müller細(xì)胞24h增殖活性，牛磺酸促進(jìn)阻滯于G0/G1期的細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期。完全缺氧24h后Müller細(xì)胞活性全面下降，各劑量?；撬岵荒苣孓D(zhuǎn)這一趨勢(shì)。缺氧引起Müller細(xì)胞特征蛋白神經(jīng)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidprotein，GFAP)和波形蛋白(Vimentin)mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)，S-100表達(dá)核質(zhì)比降低。

12、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)2.4％牛磺酸的劑量，體外實(shí)驗(yàn)0.1mmol/L、1mmol/L和10mmol/L的?；撬釢舛葴p弱缺氧引起的GFAP和VimentinmRNA和蛋白的強(qiáng)表達(dá)。S-100表達(dá)核質(zhì)比在0.1mmol/L、1mmol/L和10mmol/L的?；撬崽幚砗笤鰪?qiáng)。提示缺氧導(dǎo)致的Müller細(xì)胞功能改變可被?；撬釡p輕或阻止。 4.琥珀酸脫氫酶(Succinatedehydrogenase，SDH)和乳酸脫氫酶(Lactatedehyd

13、rogenase，LDH)的酶組織化學(xué)染色陽(yáng)性部位主要在視網(wǎng)膜外網(wǎng)狀層(outerplexiformlayer，OPL)、IPL和GCL，急性缺氧造成SDH、LDH活性在1～3天顯著下降，其下降程度隨模擬高度增加和缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而加劇，?；撬崮苊黠@緩解缺氧引起的SDH、LDH活性下降，但不能使酶活性恢復(fù)到正常水平。表明?；撬崮軌蛲ㄟ^(guò)保護(hù)細(xì)胞線粒體，抑制缺氧引起的有氧代謝酶和無(wú)氧代謝酶活性下降，在一定程度上提高視網(wǎng)膜在急性缺氧時(shí)的能量代謝。

14、 5.缺氧引起視網(wǎng)膜內(nèi)氨基酸類(lèi)遞質(zhì)/抑質(zhì)濃度改變。其中興奮性遞質(zhì)谷氨酸、甘氨酸隨缺氧程度加深含量增加，谷氨酸分布于視網(wǎng)膜IPL和GCL，?；撬崦黠@抑制了谷氨酸和甘氨酸的增加。?；撬岽龠M(jìn)視網(wǎng)膜中GLAST、GS和Kir4.1mRNA的表達(dá)，提高了攝取和代謝谷氨酸的能力。Müller細(xì)胞缺氧后內(nèi)源性谷氨酸升高，0.1mmol/L、1mmol/L和10mmol/L的?；撬峋蛊浔磉_(dá)下降，下降幅度與應(yīng)用劑量相關(guān)。提示缺氧抑制了Mülle

15、r細(xì)胞自身谷氨酸代謝，牛磺酸通過(guò)上調(diào)谷氨酸清除路徑相關(guān)因子增強(qiáng)Müller細(xì)胞對(duì)谷氨酸的調(diào)節(jié)能力。 6.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)HIF-1參與了視網(wǎng)膜缺氧適應(yīng)。急性缺氧引起視網(wǎng)膜中HIF-1α和HIF-1βmRNA水平上升。HIF-1αmRNA和蛋白在缺氧6h迅速上升到峰值，表達(dá)主要出現(xiàn)在內(nèi)核層(innernucleralayer,INL)和GCL的細(xì)胞核中，與常氧下相比，模擬5500米缺氧6hINL細(xì)胞HIF-1α細(xì)胞陽(yáng)性率從22.2

16、％提高到64.4％，牛磺酸促進(jìn)HIF-1αmRNA和蛋白的一過(guò)性表達(dá)，提高細(xì)胞陽(yáng)性率到92.6％。牛磺酸提高HIF-1βmRNA表達(dá)峰值，并將其高峰出現(xiàn)的時(shí)間延長(zhǎng)到12h，有利于HIF-1在視網(wǎng)膜中的持續(xù)作用，促進(jìn)缺氧適應(yīng)。GLUT-1mRNA和蛋白在缺氧早期下降，24h后增強(qiáng)。說(shuō)明?；撬峒ぐl(fā)GLUT-1在缺氧后期的強(qiáng)表達(dá)。提示牛磺酸能通過(guò)激活HIF-1通路上下游基因促進(jìn)Müller細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力，促進(jìn)視網(wǎng)膜的缺氧適應(yīng)。