頸椎后縱韌帶骨化癥差異蛋白驗證與功能研究.pdf

1、目的:后縱韌帶骨化癥(ossification of posterior longitudinal ligament，OPLL)是臨床上常見的脊柱疾患，發(fā)病率可高達(dá)20％～34％。OPLL的致癱幾率顯著高于其他頸椎退變性疾病，其原因包括缺乏有效的早期篩選和診斷方法、自然史不明無法確定手術(shù)時機、術(shù)后骨化物持續(xù)生長等。近年來對其發(fā)病機制的研究取得了一些成果，如COL6A1限制性片段多態(tài)性與OPLL相關(guān)、應(yīng)力因素是骨化灶進(jìn)展的重要局部因素等，

2、但其發(fā)病機制仍不明確。本研究在前期蛋白組學(xué)的研究基礎(chǔ)上，對OGN(osteoglycin)以及Ⅵα1膠原蛋白兩種差異蛋白在基因水平和蛋白水平進(jìn)行驗證其差異的真實性。并且從無后縱韌帶骨化的患者與后縱韌帶骨化患者的外周血中分離得到兩種差異蛋白mRNA，再利用逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)，實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-Time Quantitive Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)技術(shù)驗證編碼兩種蛋白的mRNA存在差異

3、，試圖為頸椎后縱韌帶骨化癥早期診斷及進(jìn)展尋找血液標(biāo)志物。采用SiRNA技術(shù)對體外培養(yǎng)的后縱韌帶骨化韌帶細(xì)胞進(jìn)行干擾，繼續(xù)培養(yǎng)的同時設(shè)定未干擾的對照組細(xì)胞進(jìn)行對比，以此來確認(rèn)OGN在后縱韌帶骨化中的作用，沉默OGN基因是否能做到阻斷骨化過程。以期尋找OPLL發(fā)生、發(fā)展過程中特異的蛋白標(biāo)記物，為臨床OPLL篩查和診斷、預(yù)后判斷、尋找治療藥物靶點、了解OPLL發(fā)生發(fā)展的分子機制提供研究基礎(chǔ)。
　　 方法:以頸椎前路椎體次全切除術(shù)中獲得

4、的OPLL后縱韌帶組織和外傷患者正常后縱韌帶組織作為研究對象。在前期蛋白組學(xué)研究得出的正常頸椎后縱韌帶與后縱韌帶骨化癥后縱韌帶組織間的差異蛋白的基礎(chǔ)上，文獻(xiàn)回顧總結(jié)各差異蛋白的基本信息、分子功能、細(xì)胞分布及其參與的生命過程，推測其在OPLL發(fā)病機制中的可能作用。對有深入研究價值的差異表達(dá)蛋白質(zhì)OGN以及Ⅵα1膠原蛋白采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)從mRNA水平進(jìn)一步驗證DIGE及質(zhì)譜結(jié)果準(zhǔn)確性。同時利用Western-blot技術(shù)在

5、蛋白水平驗證其差異。抽取頸椎后縱韌帶骨化癥患者以及無后縱韌帶骨化的患者外周血，利用逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)，以及RT-PCR技術(shù)驗證編碼兩種蛋白的mRNA之間的差異。采用SiRNA技術(shù)對體外培養(yǎng)的后縱韌帶骨化韌帶細(xì)胞進(jìn)行干擾，繼續(xù)培養(yǎng)的同時設(shè)定未干擾的對照組細(xì)胞進(jìn)行對比，以此來確認(rèn)OGN在后縱韌帶骨化中的作用。
　　 結(jié)果:在基因水平驗證了正常頸椎后縱韌帶組織與后縱韌帶骨化癥韌帶組織中存在差異，編碼OGN蛋白的mRNA在頸椎后縱韌帶骨化癥(c

6、ervical ossification ofposterior longitudinal ligament，COPLL)韌帶組織中是正常頸椎后縱韌帶組織中的3.37倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；編碼Ⅵα1膠原蛋白的COL6A1基因在正常頸椎后縱韌帶組織中是COPLL韌帶組織中的5.31倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在蛋白水平正常頸椎后縱韌帶組織與后縱韌帶骨化癥韌帶組織中存在差異，OGN蛋白在COPLL韌帶組織中是正常頸椎后縱韌帶組織中的5.00倍

7、，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Ⅵα1膠原蛋白正常頸椎后縱韌帶組織中是COPLL韌帶組織中的5.14，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在外周血中，編碼OGN蛋白的mRNA在COPLL患者中高于無后縱韌帶骨化患者，COL6A1基因在COPLL患者中低于無后縱韌帶骨化患者，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義。體外培養(yǎng)頸椎后縱韌帶骨化細(xì)胞，通過阻斷OGN mRNA可以阻斷其鈣化過程。
　　 結(jié)論:在頸椎后縱韌帶骨化癥患者的后縱韌帶組織中，無論是基因水平還是蛋白水平OGN