食管鱗癌細胞及VEGF-C siRNA對淋巴管內皮細胞增殖及成環(huán)能力的影響.pdf

1、研究背景：
　　食管癌是當今世界上嚴重危害人類生命與健康的惡性腫瘤之一，我國的食管癌的發(fā)病率高居世界首位，尤其是在太行山脈附近的省份明顯高發(fā)。淋巴道轉移是食管癌早期轉移的重要途徑，同時也是惡性腫瘤術后轉移復發(fā)的主要原因。淋巴管內皮細胞作為淋巴管最基本的單元，是食管癌淋巴道轉移的重要界面。
　　不同分化程度的食管癌的轉移力和侵襲力是不同的，促進其相關淋巴管的生成能力也是不同的。淋巴管內皮細胞的調控因子有多種，其中血管內皮生長因

2、子VEGF-C是目前公認的淋巴管生成的主要調控因子，可以與淋巴管內皮細胞表面的VEGFR-3結合，誘導VEGFR-3發(fā)生酪氨酸激酶磷酸化，促進惡性腫瘤內淋巴管生成，從而導致腫瘤細胞侵入周圍淋巴結及遠處擴散。而Endostatin是一種很強的血管生成抑制因子，能夠抑制淋巴管生長因子VEGF-C的作用，在體外強烈的抑制淋巴管內皮細胞的增殖和游走，并明顯地抑制腫瘤的生長和轉移，還可以誘導淋巴管內皮細胞的凋亡，從而抑制了腫瘤的淋巴道轉移。

3、>　　本課題采用不同分化程度的食管鱗癌細胞的培養(yǎng)上清液三維培養(yǎng)食管鱗癌相關淋巴管內皮細胞，觀察其對食管鱗癌相關淋巴管內皮細胞增殖及成環(huán)能力韻影響;構建針對VEGF-C的慢病毒載體或pSINsi-U6-siRNA真核表達載體及應用endostatin分別處理不同分化程度的食管鱗癌細胞后，取其培養(yǎng)上清液再處理食管鱗癌相關淋巴管內皮細胞，觀察對食管鱗癌相關淋巴管內皮細胞體外成環(huán)能力及增殖的影響，探討腫瘤源性微淋巴管內皮細胞與食管鱗癌細胞間的相

4、互作用及其可能機制，為進一步探討食管癌淋巴道轉移機制及其阻斷研究提供理論依據。
　　目的：
　　研究不同分化程度的食管鱗癌細胞系細胞對腫瘤微淋巴管內皮細胞體外成環(huán)及增殖的影響;研究VEGF-CsiRNA真核表達載體及endostatin對食管鱗癌相關淋巴管內皮細胞體外成管能力及增殖的影響。
　　方法：
　　1.采用免疫細胞化學及Western Blot方法檢測食管癌相關淋巴管內皮細胞中VEGFR-3、LYVE-1

5、、Podoplanin、Prox-1蛋白的表達;采用原位雜交方法檢測食管癌相關淋巴管內皮細胞VEGFR-3、LYVE-1、Podoplanin、 Prox-1mRNA的表達;
　　2.培養(yǎng)高分化食管鱗癌EC9706細胞及低分化食管鱗癌KYSE150細胞，收集其無血清培養(yǎng)基上清，作為食管癌相關淋巴管內皮細胞的條件培養(yǎng)基;分組三維培養(yǎng)食管癌相關微淋巴管內皮細胞:E1組加入EC9706條件培養(yǎng)基，E2組加入KYSE150條件培養(yǎng)基，K組

6、不更換培養(yǎng)基。計數三組細胞形成的管樣結構。消化各組細胞，采用CCK-8方法檢測細胞增殖情況。
　　3.構建慢病毒載體和真核表達載體，進行侵/轉染效率評價，選擇最優(yōu)方式。針對人源VEGF-C設計3條干擾序列SG0、SG1、SG2，并篩選出最佳干擾序列。
　　4.內皮素抑制試驗:用不同濃度的endostatin處理EC9706細胞和KYSE150細胞，采用CCK-8方法選取最佳抑制濃度。
　　5.將EC9706細胞和KYS

7、E150細胞進行細胞轉染和endostatin處理，并制備條件培養(yǎng)基。分組如下:空白對照組:未轉染的食管癌細胞的條件培養(yǎng)基。陰性對照組:轉染陰性質粒的食管癌細胞的條件培養(yǎng)基。SG1組:轉染SG1質粒的食管癌細胞的條件培養(yǎng)基。SG2組:轉染SG2質粒的食管癌細胞的條件培養(yǎng)基。內皮抑素組:最佳濃度內皮抑素處理的食管癌細胞的條件培養(yǎng)基。陰性+內皮抑素組:轉染空質粒后又經最佳濃度內皮抑素處理的食管癌細胞的條件培養(yǎng)基。SG1+內抑皮素組:轉染SG

8、1后又經最佳濃度內皮抑素處理的食管癌細胞的條件培養(yǎng)基。SG2+內抑皮素組:轉染SG2后又經最佳濃度內皮抑素處理的食管癌細胞的條件培養(yǎng)基
　　6.按照上述分組三維培養(yǎng)食管癌相關微淋巴管內皮細胞并計數各組細胞形成的管樣結構。消化各組細胞，運用CCK-8方法檢測細胞增殖情況。
　　7.統(tǒng)計學處理:應用SPSS17.0軟件處理，計量資料進行單因素方差分析，多組均數間的兩兩比較采用LSD-t法，檢驗水準α=0.05。
　　結果：

9、
　　1.免疫細胞化學、Western Blot及原位雜交檢查結果顯示:VEGFR-3、LYVE-1、Podoplanin、Prox-1蛋白及mRNA在食管癌相關淋巴管內皮細胞中均有表達。
　　2.三維培養(yǎng)結果顯示:在每一個時間點上，食管癌相關淋巴管內皮細胞成環(huán)的數目E1組＞E2組＞K組，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）;隨著時間的延長，E1組和E2組的成環(huán)數均有不同程度的減少。
　　3.CCK-8法檢測結果:三組細

10、胞的增值情況為E1組＞E2組＞K組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.侵/轉染效率評價結果:KYSE150細胞侵染效率為90％以上，轉染效率為70％左右，可以進行下游實驗;EC9706細胞侵染效率約為30％左右，轉染效率約為50％左右，達不到下游實驗要求。在此，選擇質粒轉染進行后續(xù)試驗。
　　5.質粒篩選結果:轉染后，EC9706和KYSE150細胞中SG1和SG2中VEGF-C蛋白的表達量明顯低于其他各組，即SG

11、1和SG2的抑制效果均優(yōu)于其他組。
　　6.三維培養(yǎng)結果:
　　6.1 EC9706細胞收取條件培養(yǎng)基進行三維培養(yǎng)的各組細胞的成環(huán)結果中，空白對照組＞陰性對照組＞內皮抑素組＞陰性+內皮抑素組＞SG2組＞SG1組＞SG2+內皮抑素組＞SG1+內皮抑素組，其中兩對照組之間比較，SG1+內皮抑素組和SG2+內皮抑素組比較差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，SG1組、SG2組、內皮抑素組、陰性+內皮抑素組分別兩兩比較差異沒有統(tǒng)計學意

12、義(P＞0.05)。余各組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　6.2 KYSE150細胞收取條件培養(yǎng)基進行三維培養(yǎng)的各組細胞的成環(huán)結果中，總體上比較，陰性對照組＞空白對照組＞NC+內皮抑素組＞內皮抑素組＞ SG2組＞SG1組＞SG1+內皮抑素組＞SG2+內皮抑素組，其中兩對照組之間比較，SG1+內皮抑素組和SG2+內皮抑素組比較差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05);SG1組、SG2組、內皮抑素組、NC+內皮抑素組分別

13、兩兩比較差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05);余各組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　6.3將EC9706細胞收取條件培養(yǎng)基進行三維培養(yǎng)的各組和KYSE150細胞收取條件培養(yǎng)基進行三維培養(yǎng)的各組進行比較，經過處理后的KYSE150細胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的食管癌相關淋巴管內皮細胞的成環(huán)數高于EC9706細胞的條件培養(yǎng)基。
　　7.CCK-8結果:
　　7.1在EC9706細胞收取的條件培養(yǎng)基進行三維培養(yǎng)后各

14、組細胞的增殖情況中，各組活細胞數空白對照組＞陰性對照組＞內皮抑素組＞陰性+內皮抑素組＞ SG2組＞ SG1組＞SG1+內皮抑素組＞SG2+內皮抑素組，SG2組和內皮抑素組比較，SG2組和陰性+內皮抑素組比較，內皮抑素組和陰性+內皮抑素組比較，SG1+內皮抑素組和SG2+內皮抑素組比較，差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。余各組進行比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　7.2在KYSE150細胞收取的條件培養(yǎng)基進行三維培養(yǎng)

15、后各組細胞的增殖情況中，各組活細胞數空白對照組＞陰性對照組＞內皮抑素組＞ SG2組＞SG1組＞陰性+內皮抑素組＞SG1+內皮抑素組＞SG2+內皮抑素組，兩對照組比較，SG1組和SG2組比較，SG1組和內皮抑素組比較，SG1組和陰性+內皮抑素組比較，SG2組和內皮抑素組比較，SG2組和陰性+內皮抑素組比較，SG1+內皮抑素組和SG2+內皮抑素組比較，差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。余各組進行比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。<

16、br>　　7.3將EC9706細胞收取條件培養(yǎng)基進行三維培養(yǎng)的各組和KYSE150細胞收取條件培養(yǎng)基進行三維培養(yǎng)的各組進行比較，經過處理后的KYSE150細胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的食管癌相關淋巴管內皮細胞的增殖量高于EC9706細胞的條件培養(yǎng)基。
　　結論：
　　1、不同分化程度的食管癌細胞均可促進食管癌微淋巴管內皮細胞的體外成環(huán)及增殖能力，低分化食管癌細胞效應更為明顯。
　　2、VEGF-C siRNA及endostat