自噬在輻射誘導(dǎo)肺上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：放療是臨床治療惡性腫瘤的常用方法，然而胸部照射誘發(fā)的放射性肺纖維化（radiation-induced pulmonary fibrosis,RPF），是放療最為棘手的并發(fā)癥。放射性肺纖維化病理上以成纖維細(xì)胞聚集，肺泡 II型上皮細(xì)胞損傷，細(xì)胞外基質(zhì)和膠原沉積為主要特征。我們的前期研究表明，輻射誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞（alveolar epithelial cells，AECs）發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchym

2、al transition，EMT）進(jìn)而轉(zhuǎn)化成成纖維細(xì)胞是放射性肺纖維化的重要細(xì)胞來源。自噬（autophagy）是細(xì)胞在靜息和應(yīng)激狀態(tài)下維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種高度保守的細(xì)胞行為。通過自噬體、溶酶體的相繼組裝形成自噬溶酶體，從而實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分的降解反應(yīng)。自噬的發(fā)生主要以自噬體膜結(jié)合型標(biāo)志蛋白LC3I/II、Beclin-1的誘導(dǎo)表達(dá)、p62的降解等為典型特征。在實(shí)驗室以往的研究中，我們發(fā)現(xiàn)，EMT的重要分子信號通路蛋

3、白β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在肺組織上皮細(xì)胞胞漿和胞核中表達(dá)增加，從而促進(jìn)放射性肺纖維化中成纖維細(xì)胞增多，本研究從自噬在EMT引起放射性肺纖維化過程中的作用出發(fā)，探討自噬是否通過 Wnt/β-catenin通路來介導(dǎo) EMT。因此我們希望系統(tǒng)研究自噬介導(dǎo)輻射誘導(dǎo)肺泡 EMT的作用機(jī)制，為探索放射性肺纖維化的發(fā)病機(jī)制及防止放射性肺纖維化的進(jìn)一步發(fā)展提供新的線索。
　　方法：以人支氣管上皮細(xì)胞(Beas-2B)為靶細(xì)胞，給予6

4、 Gy60Coγ射線照射，利用免疫印跡技術(shù)在蛋白水平檢測 EMT、低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）、自噬、Wnt/β-catenin信號通路的蛋白表達(dá)和活化情況，利用激光共聚焦技術(shù)檢測EMT表面蛋白的表達(dá)變化，利用流式分選技術(shù)分析EMT表面蛋白表型的改變。
　　結(jié)果：6Gy60Coγ射線照射Beas-2B細(xì)胞48h后發(fā)生明顯的EMT，建立輻射誘導(dǎo)的EMT模型。并且發(fā)現(xiàn)照射后

5、細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白被顯著的誘導(dǎo)表達(dá)，形成誘導(dǎo)低氧微環(huán)境；同時自噬標(biāo)志性蛋白 LC3I/II，Bcelin-1表達(dá)增多，而p62表達(dá)下調(diào)，促使細(xì)胞自噬發(fā)生；60Coγ射線照射后引起β-catenin蛋白表達(dá)增加，當(dāng)下調(diào)β-catenin表達(dá)水平后，EMT相關(guān)蛋白表達(dá)抑制，而自噬標(biāo)志性蛋白的表達(dá)水平并未出現(xiàn)明顯改變；抑制自噬后，Wnt/β-catenin信號通路活化受到明顯抑制；與此同時EMT相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論：60Co